长期以来,人们一直认为心肌细胞是终末分化细胞,自身没有再生能力,心肌细胞生长的唯一形式是肥大。因此认为心肌梗死后坏死的心肌不能进行自身修复,仅能通过非梗死区进行功能替代。随着细胞分子生物学的飞速发展,细胞移植治疗心肌梗死已成为冠心病治疗研究的一个重要方向。干细胞移植治疗心肌梗死的关键是要有合适的“种子”和适宜的“土壤”。从干细胞研究进行伊始,科学家寻找合适“种子”的脚步就没有停止过。常见的细胞移植种类包括:①骨骼肌成肌细胞移植:由于移植细胞不是形成心肌细胞,而是分化成能担负心脏工作的慢收缩细胞,且移植到心脏病损边缘的成肌细胞可能会成为异位兴奋点,诱发心律失常,所以临床应用前景不大。②胚胎干细胞移植:胚胎干细胞属全能干细胞,保持着分化为三个胚层的潜能,可形成骨骼、肠道、横纹肌、平滑肌、胚胎神经中枢等组织,提示胚胎干细胞可分化为心肌细胞。但人胚胎干细胞体外扩增技术尚不成熟,特别是至今还没有发现一种生长因子能诱导其分化成单独的一类细胞,加之限于人类伦理道德与法律的规范要求及来源问题,人类胚胎干细胞难以发展到临床应用阶段。③骨髓干细胞移植:骨髓干细胞属多能干细胞,被认为是目前各种干细胞中最具应用前景的一种,其特点是数量相对稳定,且在生命过程中长期存在,为临床备用提供了可靠的研究条件。最近研究发现成体骨髓中的一种非造血干细胞-间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),具有多向分化潜能,在适宜条件下能分化为骨、软骨、脂肪和平滑肌等组织,新近更证实MSCs能分化为心肌细胞,并能分泌多种生长因子诱导血管新生。且MSCs具有贴壁生长性、非吞噬性和克隆性生长等特性,采用温和的机械分离方法即可很容易地制备单细胞悬液,自体骨髓干细胞移植无排斥反应等优点。因此目前骨髓干细胞研究最深入而且应用最为广泛。　　 将骨髓MSCs输送到心梗区的方法主要有:①经心梗相关区冠脉注射。这种方法可以使足量的移植细胞进入梗死区,故效果明显优于静脉注射途径。该方法有可能成为MSCs移植治疗心梗的一种有前途的手段。②心梗区局部注射。包括心外膜和心内膜注射,心外膜注射多与冠状动脉旁路移植术(CABG)同时进行,因此对细胞移植的有效性很难加以评价。同时由于该法需要开胸,对病人创伤较大,难以单独用于临床治疗。心内膜注射应用心脏自动导航系统(NOGA)在细胞注射前能够准确判定存活、缺血和梗死的心肌范围,从而准确高效地将干细胞注入心肌。但NOGA系统昂贵,技术条件要求高,难以普及。③经静脉注射。这种经途径注入移植细胞只能有一小部分能够到达心梗区,难以达到有效的移植剂量。　　 迄今为止,尚没有理想的无毒性的标记示踪剂应用于人体对干细胞移植进行示踪,临床上只是通过超声心动图(UCG)、核素单光子断层心肌显像(SPECT)来评价梗死部位心肌收缩功能及血流改善情况,间接地了解干细胞移植的疗效,并不能直接了解干细胞的具体成活的数量、迁徙、增殖和分化情况。移植到人体心脏干细胞的命运如何?它们在体内能存活多长时间?是通过宿主心肌细胞融合,还是通过暂时停留在组织内来改善心脏功能?宿主心脏功能改善与移植细胞停留和存活之间有无关联?这些都需要对移植到人体心脏内的干细胞进行标记和示踪,才能解决以上提出的问题。动物试验常应用的标记物为5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)和绿色荧光蛋白(Green FluoresceneProtein,GFP),对供体细胞和受体有一定的毒性,而且多在移植后的一定时间内处死实验动物,对心肌组织进行切片活检方能检测。不能对同一动物干细胞在体内的迁徙、增殖等进行动态观察,所以这两种标记物并不能应用于临床。因此寻找对人体既无损害,又便于用非侵袭手段跟踪且能动态观察的细胞标记示踪的技术应用于临床研究,以对移植到人体内的骨萌干细胞进行监测,成为当前迫切需要解决的问题,否则对于干细胞移植到心脏的研究都是盲目的。应用新型的磁共振成像(MRI)对比剂——超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记骨髓干细胞,对人体既无毒副作用,又可以其独特的超顺磁性,能够利用无创的MRI对骨髓干细胞移植后的迁徙、增殖等进行动态观察。近年来,国内外已有报道证实SPIO成功标记神经干细胞、脂肪干细胞和胚胎干细胞。并在活体中采用MRI示踪肝脏,肾脏,脑,海绵体等取得了一定进展。但国内外MRI活体示踪干细胞应用于心脏的研究多集中在细胞移植后24～48h。且移植方式多采用心肌内注射。经冠状动脉移植MSCs,采用MRI活体动态示踪移植细胞的成像特点这一方面国内外少有报道。　　 一、目的：　　 1.研究经SPIO和GFP双标记的骨髓MSCs移植到心肌梗死模型的小型猪梗死区后,应用MRI进行在体动态示踪的可行性。　　 2.探讨小型猪心肌梗死模型的制备方法。　　 3.观察经冠状动脉移植双标记MSCs对小型猪梗死心肌的影响。　　 二、方法：　　 1.小型猪骨髓MSCs分离、培养和鉴定。　　 2.小型猪骨髓MSCs的成骨成脂诱导。　　 3.携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体转染MSCs并传代扩增。　　 4.超顺磁性氧化铁(SPIO)体外标记MSCs-GFP。　　 5.小型猪心肌梗死模型的建立。　　 6.经OTW球囊将MSCs移植至小型猪心肌梗死的部位,对照组用同样的方法在心梗部位注入等量生理盐水。　　 7.小型猪于MSCs移植后24h,3周,8周进行临床用MRI检查。观察MSCs经冠脉移植后的迁徙、归巢、存活和分化的具体情况。　　 8.UCG和SPECT检查:小型猪于MSCs移植前和移植后8周进行UCG检查,测定左室射血分数(LVEF)、舒张末容积(EDV)、收缩末容积(ESV)、短轴缩短率(FS)、室壁运动等。利用SPECT,经静脉注射锝[99mTc]甲氧异氰和氟[18F]脱氧葡萄糖,然后进行双核素断层采集(DISA),评价心肌灌注和存活心肌情况。　　 9.病理组织学检查心梗区及边缘区形态学改变,普鲁士蓝染色鉴定SPIO定居情况,荧光显微镜下观察GFP标记的MSCs存活数。　　 10.统计学分析　　 使用SPSS11.3软件包,数据表达采用均数±标准差,两两比较采用t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。　　 三、结果：　　 (一)、小型猪骨髓MSC的培养结果及形态学观察显示,MSCs在体外有强大的增殖能力,在第6代即可获得约9×107个MSCs。早期代数的细胞呈典型的梭形成纤维细胞的形态,随着传代次数增多形态逐渐变得扁平宽大。　　 (二)、成骨成脂诱导　　 1.成骨诱导结果显示:随着诱导时间的延长,钙结节逐渐增多、变大,镜下可见到有明显的钙沉积。21天后钙化结节茜素红染色阳性,可见大量散在的橘红色的钙结节。　　 2.成脂诱导结果显示:随着诱导时间的延长,细胞体积逐渐增大,颗粒逐渐变大、融合,胞质内有小圆球形半透明脂滴形成,呈葡萄状。部分细胞胞核挤向一侧。14天行油红O染色,可见胞核周围红染,脂滴为橙红色。　　 以上结果表明MSCs具有良好的多向分化潜能。　　 (三)、GFP基因转染MSCs结果显示:细胞转染48h后,在荧光显微镜蓝色激发光下可见大量MSCs胞浆呈明亮的绿色荧光,与白光下比较,转染率达到80％～90％。5～10代之内,荧光强度及荧光表达率未受明显影响。　　 (四)、SPIO体外标记MSCs-GFP结果显示:普鲁士蓝染色光镜下观察,SPIO浓度在12.5～100μg/ml范围内,MSCs可被成功标记,并随着标记浓度的提高,细胞质内含的蓝色颗粒逐渐增多,SPIO(25μg/ml)+LIPO(0.8μl/ml),所有细胞均可见蓝染颗粒,且聚集成堆出现,标记率达95％～100％。随着细胞的增殖分裂,SPIO仍部分存留于细胞中。　　 (五)、小型猪心梗模型的建立:20只小型藏猪均成功完成冠脉造影,但成功经皮球囊封堵法制备小型猪心肌梗死模型仅有10只,均经过ECG、UCG、SPECT。和病理证实,成功率50％。死亡10只,其中4只死于球囊封堵时心室纤颤,2只再灌注心律失常死亡,1只因指引导管深插入冠脉开口内,刺激冠状动脉痉挛死亡。1只因麻醉过深至呼吸抑制死亡,1只因麻醉不佳猪躁动致指引导管穿破左冠状窦急性心包填塞死亡,1只疑肝素用量不足至冠脉内血栓形成死亡。　　 (六)、活体动态MRI示踪检查结果显示:MSCs移植后24h可见心肌梗死部位室间隔部呈边界清晰的低信号区,与周围心肌构成明显对比,3周后低信号区有所缩小,在细胞移植后8周仍可辨认出存留的低信号区域。　　 (七)、心肌组织学检查结果显示:移植8周后心梗中央区组织切片普鲁士蓝染色未见蓝色颗粒存在,心梗边缘区可见蓝染颗粒呈簇状或团状排列,对相同切片荧光显微镜下观察,可见部分普鲁士蓝染色阳性的区域呈现绿色荧光,这表明SPIO颗粒仍停留在移植MSC内,细胞呈团状聚集。　　 (八)、UCG结果发现:与造模之前比,心梗后左室舒张末期内径(EDV)和收缩末期内径(ESV)显著延长,左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)显著下降(P<0.05),室壁活动减弱。MSCs移植8周后,MSCs移植组均较移植前好转(P<0.05～0.01),而生理盐水组无明显改善；MSCs移植组EDV和ESV较生理盐水组明显缩少(P<0.05～0.01),LVEF和FS亦较生理盐水组明显增加(P<0.05～0.01),室壁活动较生理盐水组好转。　　 (九)、双核素SPECT检查结果:99mTc.SPECT心肌显像结果显示,与造模前相比,术后1周时有明显心肌灌注缺损。MSCs移植后8周,MSCs组原先的分布稀疏区核素摄取逐渐增强,原有的缺损区部分放射性填充,充盈缺损面积明显缩小,提示左心室心肌灌注明显改善。18F-FDG-SPECT与99mTc-SPECT心肌显像对照分析显示,MSCs移植后8周,存活心肌数量增加明显高于生理盐水组。　　 四、结论：　　 1.MSCs易培养和扩增传代,且具有多项分化能力。　　 2.小型藏猪是经皮球囊扩张制造心梗模型的理想动物,并适合经梗死相关冠脉用OTW球囊行MSCs移植,可采用UCG和SPECT评价MSCs移植治疗心肌梗死的疗效。　　 3.SPIO可在体外成功标记MSCs进行干细胞移植,并通过MRI进行活体示踪,移植8周后仍可见MSCs停留在心肌梗死区边缘。　　 4.MSCs移植治疗心肌梗死,可明显提高心功能,增加LVEF和FS,缩小左室EDV和ESV,改善室壁运动。减少心肌梗死面积,促进心肌存活。改善血流动力学,延缓心室重构。