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研究背景吞噬细胞吞噬凋亡细胞是机体清除衰老细胞及受损细胞、维持内环境稳定的重要机制。凋亡细胞清除障碍在多种自身免疫病发生中发挥重要作用。细胞凋亡时,磷酯酰丝氨酸(PtdSer, PS)从细胞膜的内侧翻转到表面,暴露在细胞外环境中,继而被吞噬细胞表面的磷脂酰丝氨酸受体(PSR)识别并介导吞噬凋亡细胞,同时引起抗炎细胞因子(如TGF-β等)的释放。而未被清除的凋亡细胞会积聚诱发”二次坏死”,细胞质膜破裂释放出大量内容物,如核小体碎片、DNA、蛋白质、组蛋白成分,引发炎症反应及自身免疫性疾病。因此,对于新型PSR结构与功能的研究成为目前的研究热点。吞噬细胞表面PSR识别磷酯酰丝氨酸是凋亡细胞吞噬过程中的关键。Masafumi等发现Tim-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule-3)可以介导凋亡细胞的吞噬,是一种新型磷脂酰丝氨酸受体。Tim-3是Ⅰ型跨膜糖蛋白,人与鼠Tim-3分子氨基酸序列含有63%的同源性,均包括可变区结构域(IgV)、含糖基化位点的粘蛋白样结构域(Mucin domain)、跨膜结构域(Transmembrane domain)及含酪氨酸磷酸化基序的胞内结构域(Cytoplasmic tail)。研究发现,小鼠Tim-3分子IgV结构域的CC’及FG环能识别磷酯酰丝氨酸,是吞噬细胞吞噬凋亡细胞的重要步骤,且小鼠Tim-3分子IgV结构域中112位点精氨酸位点(R112)突变为丙氨酸(A)后(R112A)能抑制Tim-3与凋亡细胞的结合,提示该位点在Tim-3介导的凋亡细胞吞噬中具有关键性作用。与体外实验结果相符,动物实验证实,小鼠Tim-3能促进体内凋亡细胞的清除；阻断性Tim-3mAb处理导致自身免疫病模型小鼠脾淋巴结凋亡细胞及血清anti-dsDNA的增多；且高表达Tim-3的小鼠CD8+DC不仅促进凋亡细胞的吞噬,还增加对CD8+T细胞的交叉递呈作用并抑制炎症反应。上述研究强烈提示Tim-3在凋亡细胞的清除、抑制自身免疫病的发生及维持免疫耐受中发挥重要作用。然而,人Tim-3(hTim-3)介导凋亡细胞吞噬的结构基础是什么,其功能结构域及内部信号机制迄今尚未见报道。研究目的构建能有效表达主要结构域缺失及点突变的人Tim-3(hTim-3)真核表达载体,转染及吞噬实验确定Tim-3介导凋亡细胞吞噬的关键结构域,为阐明Tim-3介导吞噬凋亡细胞机制、寻找相关自身免疫病潜在治疗靶点提供理论基础。研究方法及结果1.成功建立可以有效表达主要功能域缺失及点突变的hTim-3真核表达载体以本实验室保存质粒pcDNA3-hTim-3为模板,设计引物,PCR扩增Tim-3相应片段目的基因,经HindⅡ、XhoⅠ酶切回收后,克隆入pcDNA3相应位点,构建含HA-tag融合基因的各种人Tim-3(hTim-3)表达载体。构建载体包括人Tim-3全长(hTim-3-FL)、IgV区缺失(△IgV)、粘蛋白功能域缺失(△mucin)、胞内段缺失(△cyto)、胞内段截短T1(aa1-aa277)、T2(aal-aa264)及主要酪氨酸磷酸化位点点突变(R111A、Y265F、Y272F、Y265/272F)载体。上述载体经双酶切及测序鉴定证实构建成功。利用lipo2000将上述载体DNA转染至对数期生长的HEK293细胞,48h后收集细胞,分别抽提RNA及总蛋白,RT-PCR及Western blot检测目的基因表达。RT-PCR结果显示各载体均介导相应片段Tim-3mRNA在HEK293细胞表达。HA抗体Western blot结果证实所有载体均可介导不同长度Tim-3-HA融合蛋白表达；Tim-3抗体Western blot结果显示,除△mucin外,各载体转染后的HEK293细胞中均出现两条特异性条带,推测分子量大的一条为糖基化修饰蛋白。2.成功建立凋亡细胞吞噬体系2.1地塞米松诱导胸腺细胞凋亡分离4到6周龄BALB/c鼠胸腺细胞,以1X107/ml细胞种于6孔板,在不含血清的DMEM培养基条件下加入10μM地塞米松(Dex)处理4h诱导凋亡收取细胞,3000rpm×5min,PBS洗涤两次,以Annexin V及PI染色后检测凋亡率。流式结果发现地塞米松(Dex)成功诱导胸腺细胞凋亡,早期凋亡率为(46.53±4.18)%,显著高于对照组(P<0.01)。2.2以HEK293细胞为模型成功建立凋亡细胞吞噬体系同上制备凋亡细胞,以0.1μg/ml PHrodo-SE标记后按20：1的比例与转染hTim-3-FL载体的HEK293细胞共孵育90min。之后胰酶消化细胞并离心,以300μlCHES-FACS buffer重悬,分别进行荧光显微镜观察及流式检测。荧光显微镜观察显示,hTim-3-FL过表达HEK293细胞可以有效吞噬凋亡细胞,吞噬后凋亡细胞因酸性环境显红色荧光,而未被吞噬的凋亡细胞因PH>7没有荧光,提示,以HEK293细胞为模型成功建立了吞噬凋亡细胞体系,且转染hTim-3-FL使得HEK293细胞增强了吞噬凋亡细胞的能力。流式检测结果验证了上述结果：转染空载体(pcDNA3) HEK293细胞只能吞噬少量凋亡细胞,而过表达hTim-3-FL的HEK293细胞能够有效吞噬凋亡细胞,吞噬率达到38%以上,二者相比有显著性差异(P<0.01)。3.hTim-3分子介导吞噬凋亡细胞功能域的确定为确定人Tim-3(hTim-3)蛋白中介导吞噬凋亡细胞的关键功能域,分别将构建的不同功能域缺失及突变hTim-3表达载体转染HEK293细胞,同上与PHrodo-SE标记的凋亡细胞孵育后,流式细胞术测定HEK293吞噬凋亡细胞能力,分析hTim-3功能域对吞噬凋亡细胞的影响,结果如下：3.1缺失IgV或Mucin结构域的hTim-3失去促吞噬功能hTim-3缺失胞外段结构域IgV(ΔIgV)或mucin (△mucin)之后,其吞噬率分别为(8.85±2.93)%、(2.77±2.54)%,与对照组(3.44±2.96)%相比无统计学意义。3.2R111位点是hTim-3促吞噬作用的关键位点文献报道,小鼠Tim-3分子的R112位点能够识别磷酯酰丝氨酸(PtdSer)[15]。与此相符,人Tim-3相应R111位点突变后(R111A),其吞噬率与对照组相比无统计学意义。提示hTim-3蛋白的R111是识别PtdSer的主要位点。3.3aa265-aa277是hTim-3胞内段的有效功能片段hTim-3胞内段含有6个酪氨酸位点(Y227、Y265、Y272、Y280、Y281、Y283),为研究酪氨酸位点在Tim-3介导的凋亡细胞吞噬中的作用,构建胞内段截短载体——△cyto (aal-aa224)、T1(aal-aa277)、T2(aal-aa264),同上转染HEK293细胞,构建凋亡细胞吞噬体系。结果显示,与hTim-3-FL相比,△cyto介导的凋亡细胞吞噬率显著降低(P<0.01)；但T1介导的凋亡细胞吞噬率与hTim-3-FL相似(P>0.05),T2介导的凋亡细胞吞噬率则与△cyto无显著差异。结果提示,hTim-3胞内段在Tim-3介导的凋亡细胞吞噬中发挥重要作用,且胞内段有效功能片段为aa265-aa277。3.4凋亡细胞吞噬过程中发生了hTim-3胞内段的酪氨酸磷酸化为研究酪氨酸磷酸化在hTim-3介导的凋亡细胞吞噬中的作用。收集与凋亡细胞共孵育的hTim-3-FL或△cyto过表达HEK293细胞蛋白,anti-hTim-3抗体免疫沉淀后,磷酸化酪氨酸抗体(anti-PY)免疫印迹检测发现,与hTim-3-FL转染组相比,Δcyto转染组磷酸化酪氨酸水平明显减少。提示酪氨酸的磷酸化参与Tim-3介导的凋亡细胞吞噬。3.5Tim-3介导的凋亡细胞吞噬需要其胞内Y265及Y272的协同作用aa265-aa277是hTim-3介导凋亡细胞吞噬的关键胞内片段,其中包含两个酪氨酸磷酸化位点(Y265及Y272),分别对上述位点进行单独突变及联合突变(Y265F、Y272F、Y265/272F)并比较其介导的凋亡细胞吞噬率。结果显示,两个酪氨酸磷酸化位点单独突变(Y265F及Y272F)并不影响hTim-3介导的对凋亡细胞的吞噬功能；而联合突变Y265/272F则明显减弱了hTim-3介导的对凋亡细胞的吞噬能力(P<0.05),但Y265/272F联合突变组吞噬凋亡细胞率仍显著高于△cyto组(P<0.05)。提示hTim-3介导的凋亡细胞吞噬需要其胞内Y265及Y272位点协同作用,且除酪氨酸磷酸化外,推测其它氨基酸位点修饰同样参与Tim-3介导的凋亡细胞吞噬信号传导。4.hTim-3介导的凋亡细胞吞噬不依赖于ELMO/Dock180/Rac及GULP通路文献显示,磷酯酰丝氨酸受体介导凋亡细胞吞噬的信号传导主要通过两条经典通路：ELMO/Dock180/Racl及胞浆接头蛋白GULP,两条通路最终均活化Racl引起细胞骨架重排以吞噬凋亡细胞。然而RT-PCR检测并未发现HEK293细胞中有通路分子ELMO的表达,且用GULP siRNA干扰后并不影响hTim-3及△cyto介导的凋亡细胞吞噬率。提示Tim-3介导的凋亡细胞吞噬作用并不依赖于经典的ELMO/Dock180/Racl及GULP通路,其具体通路尚有待于进一步研究。结论1.成功构建了不同截短片段及突变的hTim-3系列表达载体,为深入研究Tim-3结构与功能提供了重要实验材料。2.成功建立凋亡细胞吞噬体系,为下一步的功能验证奠定了实验基础。3.证实人Tim-3分子的胞外段结构域尤其是R111位点在识别凋亡细胞并介导凋亡细胞吞噬中发挥重要作用；胞内aa265-aa277片段是hTim-3介导吞噬凋亡细胞的关键胞内功能片段,且Tim-3介导吞噬凋亡细胞依赖于其胞内Y265及Y272的磷酸化及协同作用。4.hTim-3介导凋亡细胞吞噬的信号传导不依赖于经典的ELMO/Dock180/Racl及GULP途径。创新性和意义凋亡细胞的吞噬是目前研究热点。Tim-3作为一种新型的PtdSer受体,在巨噬细胞及DC细胞中高表达,参与多种免疫性疾病发生。因此,研究Tim-3促凋亡细胞吞噬的机制具有重要意义。本课题首次证实了人Tim-3分子在介导凋亡细胞吞噬过程中的功能结构域,为自身免疫病潜在治疗靶点的选择提供了新思路。