论文部分内容阅读
[目的]本实验通过建立大鼠低压缺氧损伤模型及蕨麻保护下的动物损伤模型,采用基因芯片、miRNA芯片、悬浮芯片和RT-PCR技术,研究低压缺氧性脑损伤后由缺氧和蕨麻保护作用引起大鼠脑皮质基因表达谱、miRNA及细胞因子的变化并分析其内在机制,找出相应靶基因,探讨它们之间的相互关系及在低压缺氧性脑损伤中的作用。[方法]缺氧损伤机制研究：将大鼠随机分为正常对照组,3000m缺氧组和7000m缺氧组,共3组,每组8只。蕨麻保护作用研究：将大鼠随机分为正常对照组,7000m缺氧组和7000m缺氧蕨麻组,共3组,每组8只,缺氧蕨麻组需提前一周进行蕨麻灌胃,对照组和缺氧组采用等量生理盐水灌胃。采用低压缺氧舱建立急性高原缺氧模型,缺氧24h后,通过HE和甲苯胺兰染色观察组织细胞形态学变化,采用干湿比重法检测各组大鼠脑含水量,通过超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等氧自由基相关生化指标证实模型可用于本次实验。应用基因芯片、miRNA芯片技术研究缺氧24h大鼠脑皮质差异表达基因、miRNA的变化。运用qRT-PCR定量检测Tac1、Mtla和Dynlt3基因表达水平。运用悬浮芯片技术检测单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、白细胞介素-1p(IL-1p)、血管内皮生长因子(VEGF)的水平。[结果]1.常规H.E染色：镜下观察可见,对照组脑皮质神经细胞呈锥形,大小均一,排列整齐,成条索状,核浆比值大,胞核居中为圆形或椭圆形,呈淡蓝紫色,核仁清晰可见,胞浆呈淡红色；低压缺氧3000m和7000m组脑皮质细胞均以坏死和凋亡为主,锥体细胞层数减少,排列稀疏、不规则；随海拔高度的增加,损伤逐渐加重,可见大部分细胞皱缩变形,胞浆深染,核碎裂及核溶解,间质中充满细胞碎片和凋亡小体。缺氧蕨麻组损伤程度较轻,以细胞水肿为主,可见部分神经细胞胞体肿胀、胞浆不规则淡染、胞核肿大淡染或消失。大部分神经细胞胞体缩小,胞核固缩成三角形或多边形,核仁消失,胞浆深染同质性嗜酸性着色。2.甲苯胺兰染色：镜下观察,应用甲苯胺蓝染色大鼠脑皮质后显示,正常对照组神经细胞核呈淡蓝色,神经元排列规则,胞浆均匀淡染,可见大量深蓝色粗颗粒状尼氏体,核仁清晰可见；3000m缺氧组,神经元排列较为规则,部分轴突断裂或消失,尼氏体减少或消失；7000m缺氧组,神经元排列散乱,细胞固缩变形,胞浆深染,尼氏体消失,轴突断裂；缺氧蕨麻组,神经元排列较为规则,部分轴突断裂或消失。3.脑含水量检测：各低压缺氧组脑含水量随海拔高度的增加而逐渐增高,与对照组相比均有显著差异(P<0.01)。与7000m缺氧蕨麻组相比,7000m缺氧组脑含水量显著增加(P<0.01)。4.生化指标检测：各低压缺氧组脑组织中SOD活性随海拔高度的增加而逐渐降低,与对照组相比均有显著差异(P<0.01)。与7000m缺氧蕨麻组相比,7000m缺氧组SOD活性显著降低(P<0.01)。各低压缺氧组脑组织中MDA活性随海拔高度的增加而逐渐增高,与对照组相比均有显著差异(P<0.01)。与7000m缺氧蕨麻组相比,7000m缺氧组MDA活性显著增高(P<0.01)。5.基因芯片检测：缺氧损伤机制研究：3000m缺氧组共有差异表达基因215个,其中29个上调,186个下调。上调基因主要有Tacl、Rgs9、Serpinb6a、Adora2a、 Penkl。下调基因主要有Siahla、Acvr1、Btbd1、Cir、Abil,上调最明显的基因是Tacl。7000m缺氧组共有差异表达基因205个,其中21个上调,184个下调。上调基因主要有Mtla、Cml3、Wfdc1、Tfpi、Vwf。下调基因主要有Zfp238、Atadl、Leprotl1、Tpm4、Fxrl,上调最明显的基因是Mtla。两组差异表达基因中共表达基因有119个,其中6个上调,113个下调。上调基因主要有Tac1、Ephx1、Cml3、Olr606、Dusp7。下调基因主要有Acvr1、Btbd1、Leprotl1、Uncl19、Canx。蕨麻保护作用研究：7000m缺氧蕨麻组与正常对照组共有差异表达基因232个,其中30个上调,202个下调。上调基因主要有TAC1、RGS9、ADORA2A、 UPP、GNG7,下调基因主要有SFRS15、STX12、CS、ASCL1、SSG1。7000m缺氧蕨麻组与7000m缺氧组共有差异表达基因37个,其中26个上调,11个下调。上调基因主要有Dynlt3、Scn4b、Rgs9、Adora2a. Gpr88,下调基因主要有Nov、Sfxn5、Wdfy1、Colla2、Ak311。两组差异表达基因中共表达基因有17个,其中12个上调,5个下调。上调基因主要有Dynlt3、Scn4b、Rgs9、Adora2a, Gpr88。下调基因主要有Nov、Sfxn5、Wdfy1、Colla2、Prkce。6.miRNA芯片检测：缺氧损伤机制研究：7000m缺氧组共有差异表达miRNA10个,其中5个上调,5个下调。上调miRNA主要有rno-miR-125b-5p、 rno-miR-127、rno-miR-7a、rno-miR-7b、rno-miR-99a。下调miRNA主要有rno-miR-32*、rno-miR-466b、rno-miR-466d、rno-miR-92a-2*、rno-miR-92b*。通过Targetscan和miRBase软件进行靶基因预测,下调靶基因有13个,主要有：Dicer1、Klhl24、St3ga16、Gpc4、Bmpr2。上调靶基因有3个,主要有：Tfpi、Dusp7、Btg2。其中,上调最显著的基因是Tfpi (ratio=2.358224)。蕨麻保护作用研究：7000m缺氧蕨麻组共有差异表达miRNA9个,其中4个上调,5个下调。上调miRNA主要有rno-miR-92b*、rno-miR-92a-2*、 mo-miR-326*、rno-miR-125b-3p,下调miRNA主要有mo-miR-345-5p、 rno-miR-668、rno-miR-363*、rno-miR-29b、rno-miR-219-5p。通过Targetscan和miRBase软件进行靶基因预测,上调靶基因有2个,主要有：Plp1(ratio=1.518752)和Mog (ratio=1.568031).7.RT-PCR:对照组Tac1呈低表达,与对照组相比,3000m缺氧组和7000m缺氧组Tac1表达量均显著增加(P<0.05),并随海拔高度的增加而增加。对照组Mtla呈低表达；与对照组相比,3000m缺氧组表达差异无统计学意义,7000m缺氧组表达量显著增加(P<0.05)。与对照组和缺氧组相比,缺氧蕨麻组Dynlt3表达量均显著增加(P<0.05),且缺氧蕨麻组与对照组Dynlt3表达量变化的更为明显。8.悬浮芯片检测：缺氧损伤机制研究：与正常对照组相比,3000m缺氧组单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、血管内皮生长因子(VEGF)表达变化不明显。7000m缺氧组表达水平明显增高(P<0.01)。蕨麻保护作用研究：与正常对照组相比,7000m缺氧蕨麻组与缺氧组MCP-1、IL-1β和VEGF表达水平显著增加(P<0.01)。与7000m缺氧蕨麻组相比,缺氧组MCP-1、IL-1β和VEGF表达水平显著增加(P<0.01)。[结论]1Tac1对缺氧较为敏感,轻重度高原缺氧表达均上调,Mtla对缺氧反应较为迟钝,轻度缺氧下Mtla基因表达水平变化不明显,而重度缺氧时Mtla基因显著上调。2不同缺氧条件下microRNA表达谱表达存在差异,miRNA通过调节靶基因,同时影响细胞因子表达,影响机体生命过程。3缺氧蕨麻组大鼠Dynlt3基因普遍上调,Dynlt3或许是蕨麻保护作用参与的主要基因之一。4蕨麻可提高脑皮质细胞活性,并逆转细胞缺氧损伤引起的细胞因子水平变化。