PD1作为一个重要的免疫检验点蛋白,对T细胞的发育和功能起着重要的作用。PD1的配体PDL1,在许多肿瘤细胞表面都有表达,它们能够抑制T细胞的葡萄糖消耗、细胞因子的产生、增殖甚至是存活率。阻断PD1的抑制信号可以促进T细胞的激活,增强机体的免疫反应。因此,PD-1抗体已成为最具前途的抗肿瘤治疗药物,代表着肿瘤免疫治疗最重大的里程碑事件。鼠源抗体的人源化主要是通过分子克隆等技术,将一些异源氨基酸序列替换为人源序列,在维持抗体亲和力和生物活性的情况下,这种改造大大降低了免疫原性,增加了在临床治疗使用中的安全性。在我们实验室先前的工作中已获得了表达PD1鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞,并成功纯化出了PD1鼠源单克隆抗体。我们首先对这株抗体的亚型进行了鉴定,该抗体的轻链和重链分别为Kappa链和Ig G链。其次我们提取了杂交瘤细胞的RNA反转录,对PD1鼠源单克隆抗体的可变区基因进行扩增调取,然后将该抗体的可变区通过分子克隆与人源Kappa链和Ig G链拼接,构建到真核表达载体上。通过流式细胞分析,将这株鼠源嵌合抗体的亲和力与鼠源单克隆抗体进行比较,发现亲和力会随恒定区的改变而下降。随后,我们又对嵌合抗体可变区中4个框架区(FR)进行了人源化,得到了两条人源化轻链VK1-39和VK2-28,以及4条人源化重链VH3-23、VH3-23-M、VH4-34和VH4-34-M。通过交叉组合一共表达了8组PD1人源化嵌合抗体。其中包含VK2-28重链的几组抗体表达极少或是亲和力极低。因此综合考虑,我们最终锁定了VK1-39&VH3-23-M组和VK1-39&VH4-34-M组,并将这两组抗体大量表达纯化。在纯化后我们用还原剂对抗体进行还原,进一步验证了抗体的空间结构正确。连同先前的PD1鼠源嵌合抗体一起,对3种抗体的亲和力进一步进行验证,排除了纯化过程中可能对抗体造成的各种影响。最终我们发现VK1-39&VH3-23-M的亲和力与鼠嵌合差异最小,且该组人源化嵌合抗体最终纯化所得量优于VK1-39&VH4-34-M。最后我们测试了VK1-39&VH3-23-M组与鼠源嵌合抗体在混合淋巴反应过程中的生物学活性,发现无论是异体反应还是同体反应,在高浓度剂量条件下VK1-39&VH3-23-M组人源化抗体都要优于鼠源嵌合抗体。综上所述,通过对恒定区的人源化,我们成功获得了PD1鼠源嵌合抗体,并对其进一步改造,将可变区中FR区也替换成人源序列,并成功验证了它们具有良好的亲和力和生物学活性。