研究背景胃癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,胃癌术后复发则是胃癌死亡率居高不下的主要原因之一。目前,血清肿瘤标志物的检测已成为临床诊断及监测胃癌的常用辅助手段之一。早期、便捷、快速、准确的检测人血液中肿瘤标志物的含量,便于及时发现肿瘤患者和对其进行适当的干预,有利于改善预后。糖链抗原72-4(Carbohydrate antigen 72-4, CA72-4)是一种重要的糖蛋白类肿瘤标志物,由CC49和B72.3两株单抗识别,其升高见于胃肠道及卵巢恶性肿瘤。对于胃癌的检测特异性较高,良性胃病升高者不足1%。有多项研究表明,CA72-4在胃癌患者中阳性率达到16%-70%,在肿瘤初期阳性率为9%,中晚期则迅速升至60.6%,而且CA72-4的水平还与肿瘤浸润深度、是否远处转移及肿瘤分期有关,尤其是在进展期胃癌患者中,CA72-4的阳性率远远高于其他肿瘤标记物。在实际临床应用中,联合其他肿瘤标志物,快速、高灵敏地检测患者体液中CA72-4的含量及变化趋势将有助于胃癌的诊断、治疗及术后病情监测。目前检测CA72-4的方法主要包括放射免疫分析法、酶联免疫分析法及电化学发光分析法等。一般而言,这些方法都能高灵敏、高特异性地检测目标分析物。但是它们的检测周期长,步骤繁琐,需要专业实验人员操作等缺点,限制了其在基层或社区医院的应用,尤其是应用在需要对病情进行严密监测或对大规模人群进行筛查时。即时检测技术(point-of-care test, POCT)由于其仪器小型化、操作简便化和结果报告实时化,极大地缩短了检测周期,能够在更短的时间内报告检测结果,使快速临床决策成为可能。所以,开发一种简单、方便的POCT检测方法来检测CA72-4也显得尤为重要。免疫层析测定法(Immunochromatographic assay,简称ICA)起源于20世纪80年代初期,将免疫标记技术与层析技术结合起来,成为一种新型的快速检测技术,也是目前市场上常见的POCT检测技术。基于层析原理把待检测物质分离,与标记物结合后再根据标记物的显色特性达到定性或定量检测的目的。免疫层析检测技术不仅保留了抗体抗原反应特异性的优点,还创新地把反应转移到膜上进行。不需要分离结合标记物与自由标记物,不需要多次加样及洗涤步骤,也不需或仅需简单的仪器,操作简单,快速(20分钟内出结果),非常适合现场检测,现在已经广泛地应用于病原微生物、人体激素或相关蛋白、寄生虫、血、尿中药物浓度、食品监管、毒品缉查等各种检测领域。免疫层析测定法作为一种简单、快速的检测技术,正朝着定量、多元化检测及高灵敏度方向发展。虽然基于胶体金等标记物的光学免疫层析检测技术也开发出了定量检测的配套仪器,但是其检测的灵敏度和一致性较低。近年来,基于磁性纳米材料的磁信号检测成为免疫层析定量检测技术的研究热点。超顺磁性纳米微球(Superparamagnetic nanoparticles, SPMNPs,简称纳米磁珠)是一种粒径为纳米级的磁性颗粒,其内部含有磁性金属氧化物,当磁性纳米粒子的粒径小于其超顺磁性临界尺寸时,粒子带有超顺磁性,使其具有良好的分散性和可操作性。在其表面还能偶联多种具有生物活性的功能基团,可以与蛋白质或其他大分子物质结合,使其具有生物相容性,可应用于多种研究领域。SPMNPs与抗体结合后形成免疫磁珠,免疫磁珠的大小和形状均一,通过抗原抗体间特异性反应,可以迅速有效地与靶物质结合。生成的复合物在磁场中具有相同的磁响应性,在外加磁场的作用下聚集,从而达到分离,检测,纯化基因、蛋白质、细胞、微生物等的目的。纳米磁珠具有强磁性,其磁性大小与纳米磁性的数量相关。纳米磁珠良好的单分散性及可操作性等特点,在免疫层析检测的定量分析领域吸引了广泛的关注。研究内容与方法本论文通过EDC/NHS法制备得到免疫磁珠,并将其作为检测探针用于构建磁性免疫层析试纸条。针对可能影响试纸条检测表现(结合垫的释放、假阳性的消除、灵敏度的提高)的各种因素,对试纸条的各个组成部分(包括结合垫、样品垫、NC膜)进行条件优化；根据层析过程中磁信号的变化情况确定磁信号检测时间；根据储存不同时间后试纸条的显色情况评价试纸条的稳定性；并用临床血清样本来进一步验证试纸条在临床检测中的应用价值,包括磁性免疫层析试纸条的检测灵敏度、特异度、与其他抗原的交叉反应性、最低检测下限、与标准检测技术电化学发光免疫检测法(Electrochemiluminescence immunoassays, ECLIA)的结果一致性等。主要研究工作包括1、标记探针的制备与鉴定。首先对制备的超顺磁性纳米磁珠进行理化性质的表征。然后采用EDC/NHS活化超顺磁性纳米颗粒,并在此基础上偶联CA72-4单克隆抗体1(mAb1),制备得到粒径为136nm,分散性良好的免疫磁珠。通过多种途径验证磁珠的偶联效果及免疫磁珠的基本特性。2、试纸条的制备。按照双抗体夹心法检测原理制备检测试纸条,从试纸条各部件材料、处理液成分、NC膜种类及长度、喷膜抗体的浓度等角度优化试纸条制备过程,并对其性能进行反复测定,以期达到最佳的层析效果。3、双抗体夹心免疫层析法检测CA72-4。利用组装优化的试纸条检测血清样本,确定最佳检测反应时间；用磁信号检测仪分析试纸条上的磁信号强度,并根据磁信号强度与梯度浓度之间的关系实现血清中的CA72-4含量的定量分析。4、临床应用价值评价。用构建的磁性免疫层析试纸条和临床常用的电化学发光检测仪器同时检测100例临床血清样本,验证试纸条检测方法的灵敏度、特异度、检测下限、交叉反应性、与标准结果的一致性等,进一步评价免疫层析检测试纸条在临床检测应用的可行性。5、试纸条稳定性评价。将试纸条干燥密封后保存在37℃环境中加速其老化过程,定期用阳性标本进行检测,通过比较每次结果的显色情况判断试纸条稳定性。将检测过的(存在C线和T线)试纸条放在60"C环境中,通过分析第3、9、12、15天T/C值的变化判断磁信号的稳定性。研究结果1、通过优化偶联反应过程,EDC/NHS偶联技术能够成功地将羧基纳米磁珠与抗CA72-4单克隆抗体(mAb1)通过化学键偶联在一起,偶联率约为35μgmAb1/1mg SPMNPs。并且通过比较偶联前后磁珠不同的磁化强度、粒径大小、表面电荷量、紫外及红外吸收峰以及在琼脂糖电泳中的泳动情况,进一步验证了偶联效果,同时也对免疫磁珠进行了表征。2、以提高免疫层析检测的灵敏度、降低非特异性反应为目的,通过优化试纸条各组成部分,最终确定NC膜种类为Pall Vivid 170,长度为1.7cm检测线上抗体的包被浓度为2mg/mL,质控线上抗体的包被浓度为1mg/mL；结合垫与上样垫的材料选取玻璃纤维素膜,结合垫处理液为5%蔗糖+2%海藻糖+0.05%Triton X-100,样品垫处理液为5% BSA+2% NaCl+0.05% Triton X-100+0.2% PVP。3、通过比较层析过程中检测线与质控线上的磁强度变化情况,确定层析20分钟后检测结果达到稳定状态；检测含CA72-4抗原标准品的血清样本,发现检测线颜色深浅与抗原浓度大小相关,其定性检测灵敏度为1IU/mL,同时通过描述检测线与质控线磁信号强度之比与抗原浓度间的关系,发现两者呈线性相关,标准曲线为y=0.00892x+0.08,(R2=0.9996),并计算出其分析灵敏度为0.38IU/mL。4、用搭建好的磁性免疫层析试纸条和电化学发光检测仪同时测定100例临床血清样本,以电化学发光法检测阴/阳性结果为标准,得出免疫层析检测方法灵敏度为99%,特异度为93%,两种方法检测结果无统计差别(χ2=0.004；P=0.95)。用含有其他抗原(CA199、CEA、HCG)的样品检测,证明试纸条与其他抗原无交叉反应。检测空白血清中已知浓度的抗原标准品(回收率试验)得出该方法的样品检测回收率为98.4%-102%(标准差为3.5%-8.2%),提示在免疫层析过程中,血清中的其他物质不会明显干扰CA72-4的检测。5、试纸条在37℃境中加速老化后的第150天仍可见清晰的检测线及质控线；NC膜上的磁性纳米颗粒在60℃环境下能够保持稳定,其磁信号强度T/C值受时间及温度的影响不大,能够保证试纸条多次重复测量的稳定性。研究结论本研究以超顺磁性纳米微球为标记物,制备免疫磁珠作为检测探针用于构建磁性免疫层析检测试纸条,初步实现了CA72-4的快速检测。该检测试纸条不仅提供定性检测分析,还能达到定量检测的目的,其检测灵敏度可以达到临床使用的要求。与常规检测方法相比,在不影响定性和定量结果准确性的前提下,又能缩短操作所需要的时间,简化了操作步骤,检测成本也大大下降。实现了对血液肿瘤标志物快速、简便、准确检测的目标,为临床检测CA72-4提供新的快速高效检测手段。该方法也适用于基层医院或者作为一种自我检测手段方便癌症患者进行病情监测,提高胃癌患者生存率及生存质量,有很好的应用前景。