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目的本实验采用体外实验和体内实验相结合的方法研究一种新的CD44变异体(CD44v16)与人乳腺癌MCF-7细胞干性之间的关系,并进一步探讨CD44v16对乳腺癌MCF-7细胞干性相关转录因子的调控,为减少乳腺癌的复发和转移、克服乳腺癌细胞多药耐药等提供新的理论依据和治疗途径。方法1.根据目的基因CD44v16序列构建过表达载Lenti-EF1a-CD44-EGFP-p GK-puro(注:构建载体时,EGFP与目的基因之间非融合表达,在目的基因C端添加3×flag),制备慢病毒并感染靶细胞MCF-7,构建MCF-7-CD44v16稳转株;构建敲减载体Lenti-U6-sh RNA-GFP-puro,制备慢病毒并感染靶细胞MCF-7/ADR,构建MCF-7/ADR-CD44v16-sh RNA细胞株。2.实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组细胞内CD44v16 m RNA的相对表达量;3.流式细胞术检测转染前后各组细胞中CD44+/CD24-细胞比例的表达;4.蛋白质印迹技术(Western blotting)检测各组转染前后的各组细胞中CD44v16以及四种干性转录因子OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4蛋白的表达差异;5.无血清悬浮培养:用无血清悬浮培养的方法从各组乳腺癌细胞中有效富集干细胞并观察其微球体的形成情况。6.构建人乳腺癌细胞株(MCF-7、MCF-7-CD44v16、MCF-7/ADR、MCF-7/ADR-CD44v16-sh RNA)裸鼠皮下移植瘤模型,测量瘤体体积,绘制出瘤体生长曲线,动态监测各组裸鼠皮下移植瘤的生长速度;通过免疫组织化学方法检测裸鼠皮下移植瘤体组织中OCT4、SOX2、c-MYC以及KLF4蛋白的差异性表达。结果1.成功构建了MCF-7-CD44v16和MCF-7/ADR-CD44v16-sh RNA稳定细胞株。RT-PCR结果显示:MCF-7-CD44v16组中CD44v16 m RNA的表达水平明显高于对照组MCF-7(P<0.01);而MCF-7/ADR-CD44v16-sh RNA组中CD44v16 m RNA的表达水平明显低于对照组MCF-7/ADR(P<0.01)。2.流式细胞术结果显示:MCF-7-CD44v16组中CD44+/CD24-细胞比例为(50.73±2.12)%,明显高于对照组MCF-7(4.49±0.28)%;而MCF-7/ADR-CD44v16-sh RNA组中CD44+/CD24-细胞比例为(7.45±0.60)%,明显低于对照组MCF-7/ADR(55.73±2.23)%,差异均有统计学意义(P<0.001)。3.Western blotting结果显示:与对照组MCF-7相比,MCF-7-CD44v16组中CD44v16、OCT4、SOX2、c-MYC蛋白的表达水平均显著上调,而KLF4蛋白的表达水平下调(P<0.05)。相反,与对照组MCF-7/ADR相比,MCF-7/ADR-CD44v16-sh RNA组中CD44v16、OCT4、SOX2、c-MYC蛋白的表达水平均显著下调,而KLF4蛋白的表达水平则上调(P<0.05)。4.四组细胞均可在无血清的培养基中以微球体的形式悬浮生长,且CD44v16过表达组干细胞微球体体积显著增大,而CD44v16敲减组细胞微球体的体积则明显减小。5.人乳腺癌细胞株裸鼠荷瘤模型的建立:成功构建裸鼠移植瘤模型,CD44v16过表达组移植瘤生长速度显著高于对照组MCF-7(P<0.05);CD44v16敲减组移植瘤生长速度明显低于对照组MCF-7/ADR(P<0.05)。移植瘤免疫组化结果显示:CD44v16过表达组瘤体组织中干性转录因子OCT4、SOX2、c-MYC蛋白的阳性表达显著升高(P<0.05),但是KLF4蛋白的阳性表达则减少(P<0.05);相反,CD44v16敲减组瘤体组织中干性转录因子OCT4、SOX2、c-MYC蛋白的阳性表达显著减少(P<0.05),但是KLF4蛋的阳性表达则增加(P<0.05)。结论CD44v16显著增加乳腺癌细胞MCF-7的干性,促进乳腺癌细胞MCF-7皮下移植瘤的生长速度,这可能是通过调控肿瘤干性转录因子OCT4、SOX2、c-MYC以及KLF4的表达来实现的。这表明CD44v16可能会成为一种新的乳腺癌干细胞特异性表面标志物,并且作为新的靶点应用于乳腺癌的治疗。