为了深入研究银杏叶黄酮合成的分子机理,为今后利用生物技术手段提高银杏黄酮含量奠定基础,本文从银杏中克隆并研究了与黄酮积累相关的几个酶基因:查尔酮异构酶(GbCHI),类黄酮3-羟化酶(F3H),烯醇式丙酮基莽草酸3磷酸合成酶(EPSP),肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)及查尔酮合成酶基因启动子(CHSP)序列。主要研究内容及结果如下:　　 (1)银杏查尔酮异构酶基因(GbCHI)的克隆、性质及表达模式的研究。利用简并PCR和RACE技术从银杏叶片中克隆得到GbCHI的cDNA序列和基因组全长。通过信息学分析发现,基因组GbCHI含有两个内含子三个外显子,GbCHI cDNA全长为926bp,含有一个735bp的开放式阅读框(OPF),编码244个氨基酸序列,预测分子量为26.29kDa,等电点为7.76。蛋白质同源序列分析表明,GbCHI与TypeⅠ型CHI同源性较高。CHIs蛋白序列进化树分析结果显示GbCHI未聚合到两类中,且分化时间早于TypeⅠ和TypeⅡ型CHI。Southern blot分析表明,GbCHI属于多基因家族;GbCHI重组蛋白大肠杆菌表达显示,其蛋白大小与cDNA序列预测蛋白大小一致,亲和层析及Western blot分析显示,重组GbCHI且含有6xHis标签,GbCHI能在大肠杆菌中正常表达;重组GbCHI酶活性分析表明,GbCHI具有TypeⅠ型CHI的酶催化特点,即催化6-羟基查尔酮生成(2S)-黄烷酮;RT-PCR分析显示,GbCHI基因在银杏不同组织中都有表达,但存在较大差异,只有成熟叶和雄蕊中表达量最高。CHI与银杏叶黄酮含量的年周期变化分析显示,CHI基因的转录水平与CHI的酶活性呈线性相关,相关系数为0.421;酶活性与黄酮的年周期变化之间也呈线性相关,相关系数为0.373。激素和胁迫诱导表达分析显示,虽然诱导表达模式不尽相同,但GbCHI转录水平能被UV-B、CCC、ABA、ALA和ETH诱导上调,而被GA抑制表达;GbCHI诱导表达模式与银杏叶黄酮的调控变化相一致,暗示GbCHI在银杏黄酮代谢过程中具有关键酶作用。　　 (2)银杏类黄酮3-羟化酶基因(GbF3H)的克隆、性质及表达模式研究。利用简并PCR和RACE技术从银杏叶片中克隆得到了GbF3H的cDNA全长序列。通过信息学分析发现GbF3H的cDNA全长为2144 bp,含有一个1671 bp的开放式阅读框(ORF),编码556个氨基酸序列。蛋白质同源序列分析表明,GbF3H与其他物种F3H同源性较低,而与菊苣(Cichorium intybus)同源性最高,为56.3％。同源建模分析显示GbF3H与P450家族蛋白的三维结构及活性位点高度相似,最终定位于微粒体膜上。F3Hs蛋白序列进化树分析结果显示GbF3H与其他植物分化较早。Southernblot分析表明,GbF3H属于多基因家族。GbF3H重组蛋白大肠杆菌表达显示,其蛋白大小与cDNA序列预测蛋白大小基本一致,亲和层析及Western blot分析显示,重组GbF3H含有6xHis标签,GbF3H能在大肠杆菌中正常表达。RT-PCR分析显示,GbF3H基因在银杏不同组织中都有表达,其中雄蕊表达水平最高,其次为成熟叶。激素和胁迫诱导表达分析显示,虽然诱导表达模式不相同,但GbF3H转录水平能被UV-B、6-BA、SA、ABA和IAA诱导上调,而伤害处理对其表达量无明显改变。GbF3H诱导表达模式与银杏ANS基因的表达模式相似,而且其上游调控序列也发现有相关的调节单元,意味着该GbF3H基因可能参与了银杏花色素的合成代谢。　　 (3)银杏烯醇式丙酮基莽草酸3磷酸合成酶(EPSPs)的克隆、性质及表达模式研究。利用简并PCR和RACE技术从银杏叶中克隆到EPSP合酶基因(GbEPSPs)的cDNA全长序列。信息学分析发现,GbEPSP的cDNA全长1403 bp,包含最大阅读框(ORF)为1035 bp,编码一个344氨基酸多肽序列。蛋白质同源序列分析表明,银杏EPSP合酶蛋白质序列与其他物种的EPSP合酶同源性较高,在81％-84％之间。进化树分析结果表明,在参试物种中GbEPSPs作为裸子植物与被子植物同聚为一类,但分歧时间相对更早。Southern blot分析表明,EPSPs基因有多个拷贝,属于一个小的多基因家族。不同组织表达分析显示,EPSPs基因在银杏的叶和果中表达量最高,其次为茎,根中表达水平最低。草甘膦处理能显著诱导银杏EPSPs基因表达量升高,紫外能上调银杏EPSPs基因表达,ABA则诱导GbEPSPs表达量先升后降;温度对GbEPSPs具有不同的诱导作用,其中42℃高温诱导最显著4 h达最大值,后又迅速降低。暗示银杏叶片中EPSPs基因在环境压力下表达量升高有可能与芳香族氨基酸向黄酮类物质的转化有关。　　 (4)银杏肉桂酰辅酶A还原酶基因(GbCCR)的克隆、性质及表达模式研究。利用简并PCR和RACE技术从银杏叶片中克隆得到了GbCCR的cDNA全长序列。信息学分析发现,GbCCR的cDNA全长为1178 bp,含有一个972 bp的开放式阅读框(ORF),编码323个氨基酸序列。蛋白质同源序列分析表明,GbCCR与其他物种CCR同源性相对较高,与挪威云杉(Picea abies)同源性最高,为68.6％;同源建模分析显示GbCCR序列与其他家族蛋白的三维结构及活性位点高度相似。CCRs蛋白序列进化树分析结果显示GbCCR与其他植物分化较早。SouSern blot分析表明,GbCCR属于多基因家族;GbCCR重组蛋白大肠杆菌表达显示,其蛋白大小与cDNA序列预测融合蛋白大小基本一致,亲和层析及Western blot分析显示,重组GbCCR含有6xHis标签,GbCCR能在大肠杆菌中正常表达;RT-PCR分析显示,GbCCR基因在银杏不同组织中都有表达,但与其他黄酮类代谢基因表达差异较大,其中茎和根中表达水平最高,其次为成熟叶。GA和农杆菌诱导表达分析显示,虽然二者都能诱导基因表达,但GA能够明显诱导GbCCR转录水平上调,而农杆菌侵染处理对其表达量无明显改变。GbCCR诱导表达模式显示,该基因可能主要参与组织及细胞壁中木质素的合成,而与抗病虫害无明显关系。　　 (5)银杏查尔酮合成酶基因启动子(GbCHSF)的调控元件及功能分析。通过染色体步移方法从银杏基因组中克隆到查尔酮合成酶基因(GbCHS)翻译起始位点上游1711bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在多个顺式作用元件,包括紫外/蓝光响应单元、植物激素响应单元、真菌诱导元件、MYB结合位点、TATA-box和CAAT-box等。亚克隆了GbCHS转录起始位点上游1402 bp序列,将其与GUS基因构建融合表达载体pBI121+CHSP,以pBI121-35s作为负对照,通过农杆菌(LBA4404)介导法分别转入烟草。结果表明,银杏CHS启动子序列能驱动GUS基因在烟草中的表达,表达具有组织差异性。其中叶片和茎中表达量较高;在诱导芽及愈伤组织中亦具有较高表达水平。结果说明,CHSP具有基本启动子功能,但表现出空间上的表达差异性