猪链球菌(Streptococcus suis)是猪的重要致病菌,在全世界广泛分布,可以引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡,也可导致生猪从业人员感染和死亡。根据荚膜多糖抗原的不同,猪链球菌分为35个血清型(1-34型,1/2型),其中猪链球菌2型(SS2)流行最广,从发病动物中分离率最高。此外,猪链球菌9型(SS9)也是一个重要致病血清型,与断奶仔猪的败血症、脑膜炎和肺炎的爆发有关,在澳大利亚、荷兰、比利时、德国等国家SS9流行较广。流行病学调查表明,在中国SS9也经常从病猪中分离到,并逐步呈上升趋势。目前,猪链球菌毒力因子及免疫原性蛋白的研究大都限于SS2, SS9的相关研究很少。本研究应用蛋白质组学方法筛选SS9毒力因子、SS9免疫原性蛋白、SS2与SS9共同抗原及基因芯片方法对猪链球菌斑马鱼模型的验证。1 SS9分泌蛋白比较蛋白组学研究应用比较蛋白组学方法,从两株不同毒力的SS9菌株分泌蛋白中检测致病性差异相关蛋白,以期发现SS9新的候选毒力因子。SS9菌株GZ0565与SH040917分别分离自病猪与健康猪。用斑马鱼模型评价两株细菌毒力,GZ0565对斑马鱼半数致死量为3.8×105cfu/鱼,而SH040917对斑马鱼不致病。同时,这两株细菌在猪链球菌已知毒力因子分布方面也存在差异。将病猪分离株GZ0565中有而健康猪分离株SH040917中没有的差异分泌蛋白经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),或MALDI-TOF-TOF-MS鉴定,分属于13种蛋白。其中5种蛋白报道与毒力相关(DNA核酸酶、O-乙酰丝氨酸裂解酶、含LysM结构的肽聚糖结合蛋白、磷酸甘油酸变位酶、5’-核苷酸酶),再用Southern杂交从基因水平验证,其中4种候选毒力因子对应基因在健康猪分离株SH040917中没有,这些蛋白的发现有助于进一步了解SS9的致病机制。2 SS9表面蛋白免疫蛋白组学研究利用免疫蛋白组学方法,以SPF小鼠抗SS9免疫血清作为一抗,与通过二维凝胶转印到PVDF膜上的SS9菌株GZ0565细胞壁蛋白杂交,从中鉴定12个免疫反应性蛋白斑点。从凝胶中切割相应的蛋白斑点,经MALDI-TOF-MS或MALDI-TOF-TOF-MS鉴定,属于8种免疫原性蛋白。它们分别是：精氨酸脱亚氨酸酶、胞外溶解物结合蛋白、延长因子TS、脑啡肽、多肽ABC运载体多肽结合蛋白、丙酮酸激酶、磷酸转乙酰酶、果糖二磷酸醛缩酶。上述免疫原性蛋白对应基因在SS9菌株中较保守,可作为SS9亚单位疫苗的候选成分。3应用免疫蛋白组学方法筛选SS2与SS9共同抗原SS2及SS9都可致猪链球菌病。研制共同疫苗是防控由SS2与SS9引起猪链球菌病的有效手段。采用免疫蛋白组学的方法,鉴定SS2与SS9共同抗原,为研制共同疫苗提供理论基础。分别以SPF小鼠抗SS2免疫血清、SS9免疫血清及免疫前对照血清作为一抗,与通过二维凝胶转印到PVDF膜上的SS2菌株HA9801细胞壁蛋白杂交,通过比较免疫转印蛋白图谱的差异,从中鉴定7个共同免疫反应性蛋白斑点。从二维凝胶中切割相应的蛋白斑点,经MALDI-TOF-MS分析鉴定,分属于4种蛋白：精氨酸脱亚氨酸酶、延长因子TS、O-乙酰丝氨酸裂解酶和1-磷酸果糖激酶。从SS9菌株GZ0565中克隆表达这4种蛋白,用SPF微型猪SS2康复血清通过免疫转印方法进一步验证其免疫原性。上述免疫原性蛋白对应基因在SS2和SS9菌株中相当保守,可作为SS2和SS9疫苗的候选成分。4斑马鱼感染猪链球菌后转录水平的变化猪链球菌是猪的重要致病菌,然而,用普通猪判定细菌的毒力问题较多,结果不确定,阻碍了猪链球菌致病机理的研究。与猪相比,斑马鱼价廉易得、体型小、操作方便,特别适合于突变库中突变株毒力的判定。本实验室已经成功地将斑马鱼作为猪链球菌的感染模型,并且被国际兽疫局所引用。应用Affymetrix斑马鱼芯片研究斑马鱼感染SS2菌株HA9801后基因表达的变化。在总共有14900转录本的芯片中,有189个基因发生变化,其中125个基因上调表达,64个基因下调表达。在上调的基因中,若干基因的功能与免疫和炎症反应、凝血过程、补体激活及急性阶段反应及应激或防御反应有关,研究表明其中有三个基因(编码血清淀粉样蛋白A、基质金属蛋白酶9和凋亡相关半胱氨酸蛋白酶)在其它物种中与猪链球菌感染后的反应相同。下调基因有肌肉特异基因和与运动或行为的正调控有关的基因。挑选12个基因应用实时定量PCR对芯片数据进行验证,结果与芯片的数据吻合。上述发现有助于用斑马鱼模型进一步探索猪链球菌的致病机理。