目的自从2003年Agre和MacKinnon获得诺贝尔化学奖以来，水通道蛋白的研究得到国际学术界的注目。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一组与水及部分小分子通透相关的细胞膜转运蛋白。目前，从哺乳动物组织中已鉴定出至少13种亚型(AQP0-12)，其中肺组织中己发现5种(AQP1，3，4，5和8)。不同AQP亚型的分布具有组织、细胞、亚细胞特异性。AQPs不仅在生理上起重要作用，而且还参与了多种病理生理过程。如上皮系统的通道作用(水分子及甘油、尿素等其它小分子)、参与脑水肿、参与细胞迁移、神经信号转导作用等。在肿瘤研究领域，机体正常表达的AQPs正日益受到关注。现已发现AQP1表达于肾腺瘤、乳腺癌、肝脏胆管细胞癌、中枢神经系统的血管母细胞瘤，AQP2表达于肾细胞癌，AQP3的检测有助于肾集合管癌的诊断和鉴别诊断，AQP5可能参与卵巢肿瘤的发生。肺癌是威胁人类生命的常见恶性肿瘤之一。其发病机理尚未完全清楚。肺癌组织水代谢和物质代谢机制也尚不清楚。研究AQPs在正常肺组织及肺癌中的表达情况，对进一步了解正常肺组织及其肺癌组织的水代谢和物质代谢，以及肺癌的发生、发展及诊断和预后都有重要意义。肿瘤的鉴别诊断在病理临床工作中占有重要地位。特别是发现转移癌时，寻找其原发部位，进一步指导临床制定出针对性的治疗方案，具有重要意义。鉴于不同AQP亚型的分布具有组织、细胞、亚细胞特异性的特点，研究AQPs在全身多种腺癌的表达分布并比较在不同腺癌中的表达情况，对肿瘤的诊断和鉴别诊断将有重要意义和临床应用价值。本研究对人肺脏正常和癌组织、及其癌细胞株中AQP3的表达情况进行研究，并分析与临床病理因素的关系，以探讨其在正常肺组织的生物学意义以及在肺癌发展中的意义。此外，我们还对全身多种腺癌及癌旁组织中AQP3的表达情况进行研究，探讨其在转移癌组织来源鉴别中的意义和临床应用前景。实验材料与方法1．标本来源：159例肺癌及其癌旁组织标本包括84例腺癌、42例鳞癌、10例小细胞癌、15例大细胞癌、4例多形性癌和4例肺转移性结肠癌，以及86例全身其他组织腺癌及其癌旁组织标本包括15例结肠腺癌、5例胃腺癌、5例前列腺癌、35例乳腺癌、11例子宫内膜腺癌、10例卵巢癌及5例甲状腺癌，均来自日本山梨大学附属医院和甲府市立医院外科手术标本。标本进行常规10％中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋。按WHO 2001年出版的《肺组织肿瘤学分类第7版》标准进行诊断分类。6例新鲜肺腺癌及癌旁正常肺组织来自山梨大学附属医院胸外科2004年10月～2005年4月手术切除标本。2．免疫组织化学和免疫荧光染色：免疫组织化学染色采用En Vision两步法。一抗使用群马大学高田邦昭教授馈赠的兔抗大鼠／人AQP3多克隆抗体，工作浓度为1：500。标本进行10分钟高压热修复后，一抗4°C过夜孵育，其他步骤按常规进行。间接免疫荧光步骤按常规进行。一抗同前，二抗使用FITC标记的猪抗兔IgG。阴性对照以PBS代替一抗，阳性对照使用AQP3阳性的正常肾组织切片。对部分可疑病例进行了重复染色。结果判定：AQP3蛋白表达定位于细胞膜，染色阳性为细胞膜呈棕黄色。按阳性细胞百分率记分：一，阴性；1+，阳性细胞数小于肿瘤细胞总数的25％；2+，阳性细胞数占肿瘤细胞总数的26-50％；3+，阳性细胞数占肿瘤细胞总数的51-75％；4+，阳性细胞数大于肿瘤细胞总数的75％。3．Western blot：检测AQP3在正常肺组织和肺癌组织中的表达。取0.1 cm~2左右的新鲜组织块，加入1ml RIPA裂解液，匀浆，蛋白定量。将含40μg总蛋白的组织裂解产物溶解到上样缓冲液中，70。处理10分钟。进行13％的SDS-PAGE电泳后，转到PVDF膜上。用5％脱脂奶粉封1小时后，于1：2000的抗AQP3抗体中4°过夜。膜经TBS洗2次后，在1：2，000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗中孵育1小时。TBS洗2次后，进行ECL显色。结果判定为转印膜上出现蓝紫色蛋白条带，用NIH图像分析系统测定各条带吸光度值，分析灰度值。4．总RNA提取和RT-PCR：使用Isogen试剂对肺癌冰冻及石蜡组织、细胞株进行常规总RNA提取后，测定OD值确定RNA浓度，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。RT-PCR按照试剂盒说明进行。PCR程序为94°C 8分；94°C 30分钟变性—57°C 1分钟退火—72°C 30秒延伸，35个周期；72°C 10分。引物序列如下：AQP3 forward 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、reverse 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′(180bp)，GAPDH forward 5′-ATCAA CCTGGCCTTTGGCTT-3′、reverse 5′-TATTCCAGCACCCAAGAAGGCTT-3′(226bp)。5．细胞培养：1例肺腺癌细胞株(A549)和1例肺鳞癌细胞株(Sq-1)均来自日本东北大学生物医学研究所细胞中心。用含青霉素G(100 U／ml)、链霉素(100mg／ml)、10％胎牛血清的RMPI 1640培养基5％CO2、37℃下常规培养。6．统计学分析：采用SPSS12.0统计分析软件行x~2检验，P＜0.05设为有统计学差异。实验结果1．AQP3在正常肺组织中的表达：在支气管假复层上皮中，AQP3强表达于基底细胞膜，弱或无表达于柱状纤毛细胞或杯状细胞膜，部分表达于支气管粘液腺分泌细胞膜。在细支气管中，AQP3中度表达于上皮全层。在肺泡组织，AQP3特异性表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞膜。2．在肺癌组织中，免疫组化结果显示：AQP3在47.8％(76／159)的肺癌组织中阳性表达，其中腺癌阳性率达70.2％(59／84)，鳞癌与大细胞癌较低，分别为35.8％(15／42)和13.4％(2／15)，在小细胞癌(0／10)、多形性癌(0／4)和肺转移性结肠癌(0／4)中均无表达。统计学分析显示，肺癌组织学类型之间、肺腺癌与其它各类肺癌的AQP3阳性率均有显著性差异(P＜0.05)。3．在肺腺癌组织中，AQP3的阳性率分别为：支气管肺泡型100％(12／12)、乳头状型82.1％(32／39)、腺泡样型52.9％(9／17)及伴粘液产生的实性型25.0％(4／16)。统计学分析显示，肺腺癌组织学亚型之间、支气管肺泡癌与腺泡样腺癌、支气管肺泡癌与伴粘液产生的实性腺癌、以及乳头状腺癌与伴粘液产生的实性腺癌之间的AQP3阳性率有统计学差异(P＜0.05)。4．临床病理学分析表明：肺腺癌中AQP3的阳性率与肿瘤分化程度呈正相关，与肿瘤临床分期呈负相关(P＜0.01)。5．Western Blot和RT-PCR分析进一步证实了肺癌细胞株和肺癌组织中AQP3蛋白及其mRNA的表达。6．对胃、结肠、乳腺、前列腺、子宫、卵巢、甲状腺等七种器官的腺癌及癌旁组织中AQP3的表达情况进行检测，正常及其腺癌组织的AQP3阳性率分别为：前列腺均为100％(5／5)，乳腺为75.0％(6／8)和14.3％(5／35)，胃腺为60％(3／5)和80.0％(4／5)，子宫内膜为14.3％(3／21)和27.2％(3／11)，结肠为37.5％(3／8)和20.0％(3／15)，卵巢及甲状腺均为0(分别为0／3、0／10和0／5、0／5)。结论1．AQP3广泛分布于呼吸道，参与正常肺组织的水及物质代谢。2．AQP3的表达在不同肺癌组织学类型中有显著差异。其中，腺癌最多，鳞癌次之，大细胞癌最少，小细胞癌、多形性癌和肺转移性结肠癌中无表达。在肺腺癌组织学亚型中，支气管肺泡癌最多。3．肺腺癌的临床病理学分析表明，AQP3的阳性率与肿瘤分化程度呈正相关，与肿瘤临床分期呈负相关，提示AQP3可能参与肺腺癌的发展。4．七种器官腺癌及癌旁正常组织中AQP3的表达程度不同，其中在甲状腺癌与卵巢癌中无表达，提示转移性腺癌的组织来源鉴别中，可能成为排除甲状腺及卵巢来源的新指标。