糖尿病胃轻瘫(diabeticgastroparesis，DGP)是常见于糖尿病患者的胃肠道慢性并发症，严重影响着糖尿病病人的消化与吸收功能。引起糖尿病胃轻瘫的原因有很多，近年来的大量研究证实糖尿病引起的胃平滑肌起搏细胞Cajal间质细胞(intestinalcellsofCajal，ICC)数量减少、网络破坏以及肠神经病变是导致糖尿病胃轻瘫的两个重要原因，但其损伤的确切机制尚不清楚。利尿钠肽(natriureticpeptides，NPs)家族是由一类结构相似的多肽所组成，最早在心脏被发现，后来在体内的其他很多部位也检测到它们的存在。NPs通过与细胞膜上的三种利尿钠肽受体相结合来发挥作用，对人体的生理功能起着重要的调节作用。本实验室以往的研究结果表明，利尿钠肽受体(natriureticpeptidereceptor，NPR)在胃平滑肌和ICC上均有分布，并且NPs抑制胃平滑肌收缩、抑制ICC起搏电流，这表明NPs在胃运动调控中起着抑制性调节作用。但是，NPs信号通路是否参与糖尿病引起的Cajal间质细胞数量减少，是否直接参与糖尿病引起的胃动力障碍以及是否参与糖尿病引起的肠神经病变目前尚未见报道。本研究运用免疫组织化学、分子生物学、细胞生物学、电生理学等实验技术，在链脲佐菌素(Streptozotocin，Streptozoein，STZ)诱导的糖尿病小鼠模型上，探讨了NPs信号通路在糖尿病胃轻瘫中的作用及其机制。　　研究结果如下:　　一、NPs信号通路对STZ诱导的糖尿病小鼠胃ICC损伤的影响　　1.通过对实验组与对照组雄性ICR小鼠的腹腔分别注射STZ溶液(200mgSTZ每千克小鼠)、安慰剂，60天后测其血糖，从实验组挑选出血糖浓度大于16mmol/L的小鼠作为糖尿病模型组。结果表明，糖尿病组小鼠的平均血糖浓度为25.6±1.2mmol/L(n=84)，明显高于对照组小鼠(6.1±0.7mmol/L，n=100);糖尿病组小鼠的平均体重降低也非明显，仅为19.3±1.6mg，而对照组为33.7±0.9mg。　　2.通过免疫荧光染色法和免疫印迹法观察了糖尿病小鼠胃平滑肌组织ICC标记物络氨酸受体激酶(c-Kit)以及膜结合干细胞因子(mSCF)的表达情况。实验结果显示，糖尿病小鼠胃组织的荧光强度均明显低于正常小鼠;免疫印迹方法(westernblot)检测结果表明，c-Kit和mSCF在糖尿病小鼠胃组织的表达明显低于正常小鼠。　　3.利用实时荧光PCR(RT-PCR)以及westernblot方法检测了糖尿病小鼠胃平滑肌组织NPs受体的表达情况。实验结果表明，糖尿病小鼠胃平滑肌组织内的三种利尿钠肽受体(NPR-A，B，C)，无论是mRNA水平还是蛋白质水平均明显高于正常小鼠;胃平滑肌张力检测实验进一步表明，CNP(C-typenatriureticpeptide)对小鼠胃窦平滑肌的收缩具有抑制性调节作用，且糖尿病小鼠胃平滑肌对CNP的反应更加灵敏。　　4.在体外培养的正常小鼠胃平滑肌细胞(gastricsmoothmusclecells，GSMCs)上观察了CNP对平滑肌细胞mSCF表达的影响。实验结果表明，CNP剂量依赖地抑制平滑肌细胞mSCF表达;NPR-C特异性激动剂cANF却对GSMCs表达mSCF没有显著性影响;然而膜通透性8-Br-cGMP能模拟出CNP对平滑肌细胞mSCF表达的抑制作用。　　5.通过MTT法间接观察了NPR-C激动剂cANF对培养的正常小鼠GSMCs增殖与分化的影响。实验结果表明，高浓度的cANF(10-6mol/L)可以明显抑制GSMCs的增殖与分化。　　二、NPs信号通路对STZ诱导的糖尿病小鼠胃底NOS神经元损伤的影响　　1.利用免疫荧光染色观察了小鼠胃底平滑肌组织HuC/D、nNOS和c-Kit的表达变化。结果表明，糖尿病小鼠胃底平滑肌组织NOS神经元、ICC-IM的数量均明显少于正常小鼠;进一步利用westernblot检测了糖尿病小鼠胃底平滑肌组织nNOS、c-Kit的表达情况，结果显示，糖尿病小鼠胃底nNOS、c-Kit的表达均明显低于正常小鼠。　　2.通过生理学和电生理学方法观察了糖尿病小鼠胃底平滑肌功能的改变。结果表明，电场刺激(Electricfieldstimulation，EFS)诱导的胃底平滑肌舒张反应在糖尿病小鼠明显减弱，而收缩反应却显著加强。进一步通过电场刺激的方法诱导胃底平滑肌细胞抑制性接点电位(inhibitoryjunctionpotentials，IJP)，通过细胞内记录的方法进行记录。实验结果表明，糖尿病小鼠胃底IJP持续时间中L-NAME敏感的(即NO组分相关的)时间明显缩短。　　3.通过westernblot检测了胃底平滑肌组织NPs三种受体的表达情况。实验结果表明，糖尿病小鼠胃底平滑肌组织内三种利尿钠肽受体(NPR-A，B，C)的表达水平明显高于正常小鼠。　　4.通过免疫组织化学方法在胃底平滑肌组织冰冻切片上观察了胃底肠神经中NPRs的分布情况。结果表明，胃底肠神经系统有NPR-A，B的分布。　　5.利用组织孵育的方法观察了NPRs激动剂CNP对胃底平滑肌组织nNOS表达的影响。实验结果表明，CNP明显剂量依赖地抑制体外孵育的胃底平滑肌组织(孵育24h)nNOS的表达。　　6.利用neuro-2α细胞株，观察NPRs、nNOS表达以及cGMP对nNOS表达的影响。首先，利用免疫组织化学方法观察了neuro-2α细胞NPs受体以及NOS表达情况。结果显示，neuro-2α细胞中存在大量的NOS阳性细胞，但NPRs染色显示阴性。因此，我们进一步观察了NPs的中间信号物质cGMP对neuro-2α细胞NOS表达的影响。结果表明，细胞膜通透性8-Br-cGMP处理24h后，高浓度的8-Br-cGMP(10-6mol/L)可以明显抑制nNOS的表达。　　以上结果提示:①糖尿病引起的胃平滑肌组织NPs信号通路上调，通过NPs/NPR-A，B/cGMP途径抑制胃平滑肌细胞mSCF表达，通过NPs/NPR-C通路抑制平滑肌增殖与分化，最终下调mSCF/c-Kit号通路使ICC数量减少;②糖尿病引起的胃底NPs/NPRs信号通路上调可能通过cGMP信号通路参与胃底NOS神经元损伤;③糖尿病引起的NPs信号通路上调通过损伤胃ICC和NOS神经元参与糖尿病胃轻瘫的发病过程。