细胞凋亡与组织器官的发育及分化、免疫细胞的发生及功能的维持、肿瘤的发生及转归等均有密切的关系，细胞以凋亡的方式主动“自杀”对维持组织的自身稳定具有积极意义。巨噬细胞作为一种重要的免疫效应细胞，其在机体免疫中的作用不可忽视，巨噬细胞的正常凋亡对于其正常行使功能有着重要的意义。影响巨噬细胞凋亡的因素有很多，其中性激素是不可忽视的一个因素。我们以前的研究表明，睾酮能够抑制感染了杜氏利什曼原虫的小鼠骨髓巨噬细胞的凋亡，那么，睾酮直接作用于小鼠骨髓巨噬细胞时，对其调亡的影响如何呢?此外，已知Fas及FasL是介导细胞凋亡的一对膜蛋白，当FasL与Fas结合时，可在数小时内诱发Fas表达细胞凋亡，且巨噬细胞上有Fas的表达；并已知NO是存在于体内有多种生物学活性的无机分子，它可以通过影响细胞物质代谢和能量代谢而造成细胞死亡，且有报道认为NO是诱导巨噬细胞凋亡的因子之一，故本研究的目的是观察在睾酮的直接作用下，小鼠骨髓巨噬细胞会否发生凋亡；如果发生凋亡，那么在这个过程中，Fas系统和NO是否参与了作用。 实验方法： 1．动物M乏一5 ter Work e57BI丫6j小鼠购自，}，IEl利‘，学I吮实验动物L!，J已、。:弓周龄雌鼠用一J二翠酮体内处理组，6周龄雌鼠用于皋酮体外处理组。2.骨髓巨噬细胞的培养及处理 (l)体内处理组:取3周龄雌鼠，腹腔注射攀酮0.11。l (0 .gmg/100耐)，每周二次，共注射3周，对照组注射等量植物油。分别取其骨髓细胞，在巨噬细胞集落刺激因子(M一csF)的作用下培养5天，使之分化、成熟为巨噬细胞。在_L述细胞中分别加入呆酮400nM或等体积的乙醇，处理2搜小时。 (2)体外处理组:分离6周龄雌鼠骨髓细胞，在!到雌细胞集落刺激因子(M一CSF)的作川下培养5天，使之分化、成熟为巨噬细胞。更换新鲜的培养液后，分别用不同浓度的架酮(l()rlM、10()nM、200 nM、400 nM)处卫l)24h，空自又寸J狱组不)] jj任何处理。3，琼脂糖凝胶电泳观察凋亡状况 分别收集翠酮体内、体外处理组处理后的骨髓巨噬细胞，提取DNA片段，在lxTI3E电泳缓冲液、1.5%琼)」片糖凝胶、澳化乙锭染色的条件下进行电泳。电泳后在紫外灯下，用(;I巧一7500凝胶电泳分析系统!!议引一}并分析结果。4.半定量I丈‘l’一I，Cl之 收集架酮体外处理组处理后的骨髓巨噬细胞，提取总I丈NA，在朴协砚引物存在的条件下进行反转录聚合酶链反应。反应产物在lx伟巨电泳缓冲液、2%的琼脂糖凝胶、浪化乙锭染色的条件下进行电泳。电泳后在紫外灯下，用GDS一7500凝胶电泳分析系统照相，以看一家基因p一找Ctj;1作为内参照分析F。，、、伙，、L、C。，spasos表达的差异。 4Sllallxi Medieal又J一liversityMaster Work5 .Western一l〕lot 在果酮体外处理组处理后的骨髓巨噬细胞中加入ZKSI)s凝胶加样缓冲液，收集各蛋白质样沉;进行硫酸十二烷酸钠一一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS一尸八GE)，电泳结束后将电泳产物在半千转移仪，卜转移到硝酸纤维素膜上。将_L述硝酸纤维素膜经适宜处理后，分别」二’川们应的一抗、二抗共同孵一育，然后经ECIJ示踪系统作用后!!谈相，以看一家基因p一乏，以in作为内参!!俄分析l.’。、S、F。、、L表达差异。6.分光光度法测定NO含量变化 收集肇酮体外处理组处理后的小鼠骨髓巨噬细胞培养液上清，依!!砚NO测定试剂盒指示方法进行测定。7.统计分析 全部数据都以均数士标准差(M士Slj)表示，采用八NoVA方法进行统计学分析。结果:1.琼脂糖凝胶电泳结果 (l)体内处理组:在体内注射泉酮或植物油后提取的小鼠骨髓巨噬细胞，经乙醇处理2斗小时后，其!)NA提取物电泳后仅有极其微弱的凋亡梯带出现;而经肇酮处理2吐小”J一后，却出现了显著的调一亡梯带。 (2)体外处理组:经呆酮处理后，除ZoonM、理oonM处理组出现了明显的凋亡梯状带外，其它组观察不到凋亡梯状带的存在。2.半定员I{’l’一l)CR结果 半定最121’一I’er之结果显示，小鼠渭，髓巨噬细胞一矛:，、、l了。、、I川s丈NA的表达随翠酮浓度的增加而增高(只0.05)，C:L、p。、。8在!nl枷A水平的表达也Sllanxi Medical UlllversityMaster W6rk随着翠酮浓度的增加及FzlS、l了aSL表达的上调而剧烈增加。:3.Western一blot结果 western一b10t结果表明，小鼠骨髓巨噬细胞中价ts、I子a、L蛋自的表达随翠酮浓度的增加而增高(/丫0.05)。理.NO含量变化 分光光度法测定结果显示:随着呆酮浓度的增加，小鼠骨髓巨噬细胞培养液上清中的NO含量与对照组相比逐渐下降。结论:1.皋酮在体内作用于小鼠骨髓巨噬细胞后，对其凋亡诱导作用不大， 而在体外直接作用于小鼠骨髓巨噬细胞后，可诱导其凋亡。2.在翠酮诱导的小鼠骨髓巨噬细胞凋亡中，FaS系统起着非常重要的作 少月。3.皋酮可抑制小鼠骨髓巨噬细胞NO的产量，这说明NO在架酮诱导的