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前言乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤之一,严重威胁女性身也健康[1]。尽管早期检测和有效的治巧措施能延长患者的生存时间,但很多患者仍然死于肿瘤的复发和转移[2]。因此,迫切需要寻找一个敏感性好且能早期预测乳腺癌患者预后的分子生物学标记物,为临床对乳腺癌的预后做出早期预测提供一定的参考依据,从而有助于采取及时有效的治疗措施。miRNAs是一类长度在18-22nt的单链小分子RNA,它不编码任何蛋白质,具有强大的调控基因表达的作用[3-5]。成熟microRNA的主要功能是结合到信使RNA(mRNA)的3’端非编码区域(3"UTR)的互补序列,促使相结合的mRNA降解或抑制其翻译拘。大量研究表明microRNA参与生命进程中一系列重要的过程,包括细胞发育、増殖、分化、调亡W及肿瘤的发生发展等,并将成为潜在的治疗祀点[7]。因为肿瘤的病变过程涉及多基因的调控,所W研究microRNA与肿瘤基因相关的功能,能吏全面地了解肿瘤的发生发展,从中获得有助于预防、诊断、治疗及预后的信息。microRNA-320a(miR-320a)定位于人的第8号染色体(GRCh37.p5),已有研究表明miR-320a在几种恶性肿瘤中异常表达,并且参与肿瘤的发生、发展和转移,如肠癌,膜腺癌[8-10],但是miR-320a在乳腺癌中的表达及与患者预后的关系究竟如何,目前国内外尚未见系统性的研究报道。我们人乳腺组织标本作为研究对象,应用real-time PCR方法对人浸润性乳腺癌及癌旁新鲜冰冻标本中miR-320a的表达进行检测,并且用原位杂交方法检测了人乳腺癌石蜡包埋组织中miR,320a的表达,运用统计学方法分析miR-320a的表达与患者临床病理学指标及预后的相互关系。随后,采用计算机软件W及一系列细胞学实验筛选出Rabl4作为miR-320a的候选铅基因,并进一步分析其与miR-320a的鞭向关系。该研究不仅对了解肿瘤的生物学特性具有明显的理论意义,而且也具有一定的临床价值和社会效益。第一部分miR-320a在乳腺癌组织中的表达及与临床病理学指标的相关性和预后分析目的 检测人乳腺癌新鲜及石蜡包埋标本中miR-32化的表达,并统计分析miR-320a的表达与患者临床病理学指标的相关性及预后分析。方法 首先采用real-time PCR方法在19对新鲜冰冻浸润性乳腺癌及其癌旁組织中检测miR-320a的表达,然后在130例浸润性乳腺癌和15例乳腺原位癌石蜡包埋组织中用原位杂交的方法检测miR-320a的表达情况;用统计分析软件评价miR-320a表达与患者临床病理学指标和预后的相关性。结果 Real-time PCR发现miR-320a在浸润性乳腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P<0.001)。原位杂交结果表明miR-320a高表达于80%的乳腺原位癌以及46%的浸润性乳腺癌,miR-320a在乳腺原位癌中的表法水平明显高于浸润性乳腺癌,两者有显著的统计学差异(P=0.013);miR-320a的表达与TNM临床分期(P<0.001)、肿瘤大小(P=0.046)、淋巴结转移(p<0.001)、远处转移(P=0.006)呈负相关关系,随着肿瘤恶性程度的增高,miR-320a的表达逐渐下降;miR-320a与患者预后呈正相关,miR-320a高表达者较低表达者生存期长;miR-320a在乳腺癌患者的预后分析中是一个独立的预后相关的分子指标(户=0.047,HR=0.221,95%CI:0.050-0.979).结论 miR-320a在浸润性乳腺癌组织中低表运,与患者的临床分期、淋巴结转移、肿瘤大小、远处转移呈负相关;miR-320a与患者预后呈正相关,高表达者较低表达者生存期长;miR-320a在乳腺癌患者的预后分析中是一个独立的预后相关的分子。第二部分miR-320a的表法与其靶蛋白Rab14相关性分析目的 分析miR-320a在乳腺癌中的作用机制,即下游靶基因的预测与验证。方法 采用生物信息学方法预测miR-320a的可能作用靶基因;通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-320a和其靶基因的相互作用;并进一步通过real-time PCR及western blot检测转染pre-miR-320a作用后潜在靶基因mRNA及蛋白表达;应用western blot及免疫组织化学方法分别检测miR-320a靶蛋白在临床乳腺组织标本中的表达并探讨其与miR-320a的相关性。结果 结合生物信息数据库以及Kaplan-Meier Plotter生存分化并结合文献阅读,选取Rabl4作为候选靶基因;双荧光素酶报告实验显示miR-320a显著抑制Rab14的报告基因的活化转染pre-miR-320a后,Rab14 mRNA及蛋白水平表达均明显降低;WestemBlot结果显示在19对组织中,和癌旁组织相比,癌组织中Rabl4蛋白有12例升高,4例降低,3例无改变。免疫组织化学染色发现Rabl4蛋白主要表达于胞浆中;在130例浸滴性乳腺癌标本中,77(59.2%)例样本表现为Rab14高表达;Rab14的表达与肿瘤大小(P=0.034)、淋己结转移(P<化001)、远处转移(P=0.007)、临床分期(P=0.001)、病理分级(P=0.035席关,随着肿瘤恶性程度的这部增高,Rab14的表达逐渐增高;miR-320a的表达与Rab14蛋白呈负相关,相关系数为-0.50,P＜0.001l;Kaplan-Meier生存分析揭示,Rab14的高表达与乳腺癌患者较短的生存期之间有显著相关性(P=0.001)。结论miR-320a可能通过下游靶基因Rab14发挥其在乳腺癌中的作用。