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肿瘤抗原OVA66(GenBankAccession No.AF283301)是本实验利用人卵巢癌重组cDNA表达文库通过SEREX（Serological analysis of recombinant cDNA expressionlibrary）方法筛选并鉴定的一个新cancer/testis抗原（CT抗原）。该抗原与在白血病CML重组cDNA文库中筛选出的肿瘤抗原CML66具有高度的同源性。目前对于肿瘤抗原OVA66的研究表明，其蛋白表达水平不论是在临床肿瘤组织样品或是恶性肿瘤细胞株中均呈特征性高表达。将OVA66基因外源性过表达于正常小鼠成纤维NIH3T3细胞中能够体内、外诱导NIH3T3发生恶性转化(oncogenic transformation)，具有其他oncogenes相似的生物学功能，提示OVA66与肿瘤的发生、发展密切相关。OVA66生物学功能和致瘤机制的研究具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。本课题主要从以下三个方面进行相关研究：1)在蛋白水平上检测不同类型肿瘤细胞株和正常细胞株中OVA66的表达水平，并通过建立稳定干扰或过表达肿瘤细胞系，探讨OVA66蛋白对肿瘤细胞生物学功能的影响：发现OVA66在多种类型肿瘤细胞株中呈特征性高表达，而在正常细胞低表达或不表达；通过shRNA干扰及基因转染技术，体内、外实验结果证实OVA66在肿瘤细胞株如SK-OV-3，HO8910等的干扰或过表达显著抑制或促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及抗凋亡能力；2)以前期实验结果为基础，利用高通量蛋白芯片技术，检测OVA66蛋白的表达变化引起相关信号分子或蛋白的异常活化或表达，探究OVA66可能参与的细胞信号通路：采用高通量的蛋白组学技术，即细胞信号通路相关蛋白磷酸化抗体芯片技术，以对照组和OVA66稳定干扰组SK-OV-3细胞为研究对象，对OVA66可能参与影响的信号通路进行筛选。RTK蛋白磷酸化芯片显示，OVA66干扰组SK-OV-3细胞多个信号分子磷酸化水平发生明显下调，如IGF-1R分子的磷酸化水平显著降低； MAPK蛋白磷酸化芯片结果表明ERK1/2和HSP27分子磷酸化水平与OVA66蛋白表达水平呈正相关。并通过Western Blot法在多个肿瘤细胞株中证实OVA66表达水平对于IGF-1R-ERK1/2-HSP27信号通路的活化程度具有重要的影响作用。以上结果表明OVA66蛋白是通过影响IGF-1R、ERK1/2、HSP27分子的磷酸化水平发挥促肿瘤发生、发展的生物学功能；3)利用相关信号通路的拮抗剂或特异性siRNA干扰技术阻断相关信号通路和分子活化，对OVA66在肿瘤细胞中生物学功能的影响：利用IGF-1R信号通路的特异抑制剂Linsitinib或特异小分子干扰RNA(siRNA)，阻断该信号通路的活化，结果表明特异阻断IGF-1R信号通路明显抑制OVA66蛋白促进肿瘤细胞增殖、侵袭及抗凋亡能力的生物学功能，提示OVA66生物学功能的发挥依赖IGF-1R信号通路的异常活化，证实OVA66与IGF-1R信号途径密切相关。由于IGF-1R对其下游的ERK1/2-MAPK信号通路的调节很大程度依赖于MDM2介导的IGF-1R分子的泛素化水平，而本实验室前期研究发现OVA66与MDM2基因在HeLa肿瘤细胞株中的表达密切相关。免疫沉淀（IP）实验结果显示OVA66蛋白的表达水平显著影响IGF-1因子刺激下的IGF-1R泛素化水平；并通过Real-time PCR及Western Blot法验证OVA66稳定干扰的肿瘤细胞中MDM2基因的mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组细胞。上述结果表明肿瘤抗原OVA66参与调节肿瘤细胞IGF-1R及下游ERK1/2-HSP27信号途径的异常活化；OVA66与MDM2基因的mRNA及蛋白表达水平密切相关，二者共同参与影响配体结合诱导条件下的IGF-1R分子的泛素化水平，促进下游ERK1/2-MAPK信号通路的活化，从而发挥促肿瘤发生、发展的生物学功能。