背景股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head, ONFH)是由于不同病因引起的股骨头血液供应破坏或骨细胞死亡引起的病理过程。临床上可分为创伤性和非创伤性两大类,前者发病机制已较清楚,后者常是全身性疾病的一个合并症,发病机制至今仍未明了。激素性股骨头坏死[’](steroid-induced avascular necrosis of the femoral head, SANFH),属非创伤性股骨头坏死,多发生在长期或大剂量应用超过自身生理需要量的肾上腺皮质激素后引起的股骨头坏死,是股骨头坏死中常见的类型。其主要临床表现为髋关节疼痛、活动受限,跛行为主,后期致残率高,严重影响患者的健康水平和生活质量。临床上常见于自身免疫性疾病、小儿肾病、类风湿性关节炎、器官移植必须长期服用激素者。据国内外统计资料显示有激素原因引起的ONFH占ONFH总数近一半,而在我国需要治疗的ONFH患者为500-750万,每年新发病例数为15-20万,且非创伤性ONFH多发生在青壮年。目前,对于自身免疫性疾病的治疗主要采取激素疗法,尤其在2003年抗击非典型性肺炎(SARS)期间,激素在发挥重要作用的同时,也造成了更多的股骨头坏死患者[5-6],加之近年来激素的不规范应用,造成因过服激素而引起股骨头坏死者呈明显上升趋势。由于对其病理机制并不十分清楚,目前多种治疗方法并不十分肯定。祖国医学以整体观念、辨证论治为指导,在疾病的认识和治疗上有其独特的见解。采用中药淫羊藿是以补肾阳、强筋骨、祛风湿等中医药理论为基础,结合现代医学研究,该药具有改善骨代谢,促进成骨细胞生成的作用,在对SANFH达到系统性认识的基础上力求开发出安全有效的药物,更好的服务于临床,使必须服用激素的患者在应用激素的的同时应用该药,起到对疾病的自然病程进行干预,改变疾病的演化和破坏过程,必将能极大降低本病的发生率和关节致残率,最终达到改善功能或推迟施行人工关节置换术的目的,对提高患者的生活质量,减轻患者的痛苦、经济负担将产生重要意义。目前存在的问题：现代医学对SANFH的病理机制研究还处在试验阶段,国内外的报道还很少,很多结论只是建立在假说的层次上。在治疗上没有特效方法,除了手术置换关节没有更有效的药物,而选择外科手术风险较大患者往往难以接受。中医药治疗虽然有一定疗效,毒副作用小,因而得到广大患者的认可。但是也存在许多问题,主要表现在两个方面：一是对SANFH的病因病机和辨证分型目前尚未形成统一的理论和认识,二是临床报道较普遍,但动物实验研究和探讨中药治疗本病机理的研究较少。因此,我们在继承和利用中医药关于治疗SANFH的传统理论同时,还应注意借助现代科学手段,多途径、多学科地对中医药治疗SANFH进行深入的研究。目的：通过系列研究,探讨解决以下问题：1.研制激素性股骨头坏死兔模型的方法,揭示PPARγ、ALP、骨钙素mRNA及骨小梁面积比、空骨陷窝率、脂肪细胞平均直径与激素性股骨头坏死形成之间的关系。2.使用淫羊藿提取液作用于股骨头坏死动物模型,揭示在淫羊藿的干预下激素性股骨头坏死PPARγ与脂肪分化的关系。3.使用淫羊藿提取液作用于股骨头坏死动物模型,揭示在淫羊藿的干预下激素性股骨头坏死ALP、骨钙素mRNA与成骨细胞转化活性的关系。4.使用淫羊藿提取液作用于股骨头坏死动物模型,观察在淫羊藿的干预下激素性股骨头坏死的骨小梁面积比、空骨陷窝率、脂肪细胞平均直径的变化情况,以确定淫羊藿防治该病的相关机理。第一部分：激素性股骨头坏死兔模型及淫羊藿提取液的制备1方法：健康成年新西兰白兔30只,雌雄各半,体重在2.5-3.0kg。颗粒饲料喂养,单笼饲养。由河南省动物实验中心提供。淫羊藿提取液,其成分为淫羊藿单味药提取物悬浊液。含生药2.3g/ml,由河南中医学院第一附属医院制剂室生产。造模[7]：所选用动物喂养1周后,采用随机分组法分为两组,即空白组10只,造模组20只,在体重及雌雄数等方面分别对两组动物差别行t检验,确保无统计学意义后进行试验。所有参加造模组动物第一次应用马血清10mL／kg经兔耳缘静脉注射,间隔3周后,再次经兔耳缘静脉注射马血清6mL/kg；间隔2周后,按45mg／kg的剂量给予甲基强的松龙腹腔注射,连续3d,每天注射1次。注射激素期间,为了预防感染,每只动物每天腹腔注射青霉素10万单位,连续7d预防感染。空白组动物常规饲养。至最后一次注射激素后将造模组剩余19只动物随机选取16只分为两组即模型组和试验组。从未造模动物中选取8只组成空白组,(剩余4只动物空气栓塞方法处死)至此,整个实验组别划分完成,即空白组、模型组和试验组,每组有动物8只。给药剂量方法及样本采集：白分组第一天开始,空白组和模型组动物每天给10ml生理盐水灌胃,试验组动物每天给10ml淫羊藿提取液灌胃,共连续灌胃8周。2结果造模完成后随机取造模动物1只及正常动物1只,用空气栓塞方法处死,解剖股骨头病理切片,观察证实股骨头坏死造模成功。第二部分：淫羊藿对激素性股骨头坏死影响的实验研究实验一：淫羊藿对激素性股骨头坏死OSTEmRNA. PPARγmRNA的影响1方法在试验结束后三组动物分别在灌胃第8周分别选取8只,麻醉后迅速解剖出股骨头及股骨,并抽取股骨近段近骨骺处液态的红骨髓约5ml,置入装有DMEM培养液的无菌离心管中带至实验室,保存待检。用Trizol法提取治疗组骨髓总RNA, FQ-PCR按试剂盒说明书进行,检测PPARγ mRNA和Osteocalcin mRNA的表达。设置好PCR扩增引物,同时设模板和空白对照。在ABI7300荧光定量PCR仪上进行检测。扩增反应条件：①50℃2min。②95℃5min,95℃15s,60℃45s,40个循环；PCR反应完毕后,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性,利用公式mRNA=2-ΔCt计算股骨头组织中两种基因mRNA的相对表达量并进行分析。2结果试验组和空白组细胞中PPARγmRNA均呈低表达(表达值为2.31±0.29和1.84±0.15),两组间差异无统计学意义(P>0.05)。模型组细胞中PPARγmRNA呈高表达(4.75±0.44),与试验组、空白组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)模型组细胞中osteocalcin mRNA呈低表达(6.86±1.05),试验组和空白组细胞中osteocalcinmRNA呈高表达(表达值为12.70±1.27和14.07±0.80),与模型组差异均有统计学意义(P<0.05),而试验组与空白组间的差异无统计学意义(P>0.05)。实验结果显示,模型组中PPARγmRNA呈高表达,与空白组与试验组间差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组中Osteocalcin mRNA的表达水平显著低于空白组与试验组(P<0.05)。实验二：淫羊藿对激素性股骨头坏死骨小梁面积比、空骨陷窝率、脂肪细胞平均直径、ALP活性的影响1方法将取出的股骨用温生理盐水冲洗数次,在超净工作台内用钳子夹碎股骨两端,用10ml DMEM培养液冲洗骨髓腔多次,反复吹打,将团块细胞吹匀。过滤、离心之后加入含10%FBS的DMEM培养液以2×106/ml细胞密度接种于75cm2细胞培养瓶中,置于37℃,5%CO2,饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养,细胞80%汇合后传代。取第二代MSCs以每孔1×105个细胞接种于6孔培养板,定为实验的Od。在倒置显微镜下逐日观察MSCs形态及生长分化情况。实验第10天时,一部分细胞用反复冻融法进行裂解,离心取上清用ALP试剂盒测定细胞内ALP活性；实验第21天时,其余细胞油红“O”染色,光镜下观察脂肪细胞形态并计数。2结果2.1细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性测定：模型组与空白组、试验组相比P<0.05,ALP明显降低,有统计学意义,说明成骨细胞代谢降低,骨吸收增加；试验组与空白组相比P>0.05,ALP活性无明显变化,无统计学意义。2.2骨小梁面积比、空骨陷窝率、脂肪细胞平均直径统计：试验组和空白组细胞中骨小梁面积比均处较高水平(表达值为42.25±3.86和55.75±3.5),两组间差异无统计学意义(P>0.05)。模型组骨小梁面积比处较低水平(29.75±0.75),与试验组、空白组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。试验组和空白组细胞中空缺骨陷窝率均处较低水平(表达值为13.75±1.50和10.25±2.26),两组间差异无统计学意义(P>0.05),模型组空缺骨陷窝率处较高水平(20.50±2.08),与试验组、空白组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。试验组和空白组脂肪细胞平均直径均处较低水平(表达值为38.00±2.94和29.50±3.10),两组间差异无统计学意义(P>0.05)。模型组脂肪细胞平均直径处较高水平(52.25±4.78),与试验组、空白组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。第三部分：淫羊藿治疗激素性股骨头坏死的临床研究1方法2010年11月至2012年11月,共有30例激素性股骨头坏死病人纳入研究。试验组和对照组各15例。试验组治疗方法：改良髓芯减压并强化力学支撑术加中药淫羊藿,对照组治疗方法：单纯改良髓芯减压并强化力学支撑术。病例来源于河南中医学院第一附属医院骨科2结果2.1治疗3、6个月时髋关节功能比较：经秩和检验,两组髋关节功能治疗前后自身比较,均有显著性差异,P<0.01,说明两种治疗方法对股骨头坏死均有较好效果；两组间比较,有显著性差异,P<0.05,试验组髋关节Harris评分明显高于对照组。2.2治疗3、6个月时疗效比较：经CMH检验,两组疗效的优良率比较,p<0.05,试验组优良率为86.67%,对照组优良率为60.00%,试验组优良率优于对照组。2.3治疗6个月时影像学比较：经CMH检验,两组间影像学比较,p<0.01,试验组好转3例占20%,稳定11例占73.33%,不稳定1例占6.67%,恶化0例占0.00%；对照组好转1例占6.67%,稳定11例占73.33%,不稳定2例占20%,恶化1例占6.67%,试验组影像学变化优于对照组。结论1通过马血清加甲强龙方法可以成功制备激素性股骨头坏死兔模型。2中药淫羊藿具有抑制激素所引起的股骨头坏死PPARγmRNA的高表达水平,防止骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化。中药淫羊藿可以抑制激素所引起的Osteocalcin mRNA的低表达水平。3激素可以降低骨组织中ALP活性,中药淫羊藿可以抑制激素引起的ALP活性降低,激素可引起股骨头空骨陷窝比率升高、脂肪细胞直径增大及骨小梁面积比降低,淫羊藿可改善上述变化。4改良髓芯减压并强化力学支撑术配合中药淫羊藿汤剂内服及单纯改良髓芯减压并强化力学支撑术治疗激素性股骨头坏死,均能改善髋关节功能,在一定程度上防止股骨头塌陷并促进坏死的股骨头修复。相比前者优于后者。