克隆病(Crohn’s disease)是一种发生于肠道的自身免疫性疾病。近五十年来,其发病率在发达国家呈上升趋势,而在卫生条件不足、欠发达的第三世界国家则较低,由此有学者提出“卫生假说(hygiene hypothesis)”,即儿童早期对一些病原体如某些蠕虫、病毒或细菌等的接触有助于自身耐受的形成和维持免疫平衡,从而减少过敏性和自身免疫性疾病的发生。此机制可能与蠕虫感染可以调节Th1或Th2免疫反应有关。蠕虫的慢性感染可以引起以IL-4升高为主的Th2类反应的发生,而IL-4可抑制Th1类细胞的分化,因此IL-4可以对宿主的免疫进行调节,并且在自身免疫性疾病的发生发展中起重要的作用,它可以抑制Th1类反应相关的自身免疫性疾病。2,4,6三硝基苯磺酸(trinitrobenzesulfonic acid, TNBS)诱导的结肠炎具有与克隆病类似的发病特点,是以Th1型介导为主的免疫反应,产生高水平的前炎症因子IFN-γ,从而在结肠引发严重的炎症。血吸虫感染后幼虫和成虫引起Th1为主的免疫反应,产卵后虫卵诱发以Th2为主的免疫反应。而调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Tregs),这群具有免疫抑制作用的细胞亚群可以识别自身抗原肽,分泌抑制性细胞因子如IL-10,从而抑制自身反应性T细胞和辅助T细胞的活化,抑制过度的Th1/Th2极化,防止自身免疫的发生并控制各种形式的免疫反应。在血吸虫的感染中,调节性T淋巴细胞也参与其免疫调节,但有关血吸虫诱导产生的Tregs在CD中的作用目前还未见报道。本文探讨了日本血吸虫卵对TNBS诱导的小鼠结肠炎的影响及调节性T淋巴细胞在日本血吸虫卵对小鼠溃疡性结肠炎的免疫调节中的作用。本论文包括日本血吸虫卵对TNBS诱导的小鼠结肠炎保护作用的观察和日本血吸虫卵对TNBS诱导的小鼠结肠炎保护作用机制的研究两部分:一、日本血吸虫卵对TNBS诱导的小鼠结肠炎保护作用的观察目的观察日本血吸虫卵对TNBS诱导的小鼠结肠炎的保护作用。方法50只6～8周龄雌性BALB/c小鼠,随机分组,10只/组,分别为正常对照组、乙醇对照组、血吸虫卵免疫对照组、TNBS诱导的结肠炎组和虫卵免疫后TNBS诱导的结肠炎组。虫卵悬于100μl pH 7.4 PBS,以10 000个虫卵/鼠,分别于第0、7、14和21天经腹腔注射免疫小鼠,正常对照组小鼠仅给予相同剂量PBS。末次免疫后第5天,小鼠乙醚轻度麻醉后,用直径2 mm的灌肠器从肛门插入结肠约4 cm处,实验组小鼠注入2% TNBS (50%乙醇配制) 0.1ml,正常对照组和乙醇对照组分别注入等体积的生理盐水、50%乙醇,使灌注液能够到达盲肠,并保持小鼠垂直状态约30 s。诱导结肠炎后第6天,剖杀小鼠,剪取肛门至盲肠肠管,沿肠系膜纵轴剪开,用冰生理盐水冲洗后,常规10%甲醛固定24 h,石蜡包埋切片,苏木精-伊红染色后,显微镜下进行组织学观察,并对炎症进行分级。同时无菌取脾,制备淋巴细胞悬液,调整细胞数至3×106/ ml。将小鼠脾淋巴细胞悬液加至24孔培养板中,1 ml/孔,每孔分别加Con A 5μg/ml,双抗(青霉素和链霉素) 100 U/ml,置37℃, 5 % CO2培养箱,72 h后离心取上清液,用ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中的IFN-γ和IL- 4水平。观察各组小鼠体重、粪便情况、结肠病理改变及细胞因子水平的变化。结果生理盐水、50%乙醇处理和单纯虫卵免疫组小鼠未见稀便、粘液便或血便,其体重随着时间的延长呈逐渐增长趋势;未给予虫卵免疫的TNBS诱导结肠炎组小鼠在诱导后第1天即出现不同程度的稀便或粘液血便;给予虫卵的结肠炎小鼠则多为稀便,粘液血便少见,但两者在TNBS诱导后体重均明显下降,与其它组比较有显著性差异(P < 0.01)。给予虫卵免疫的结肠炎小鼠体重从第3天开始逐渐恢复,至第5天接近未诱导结肠炎小鼠水平。TNBS诱导结肠炎后第6天,剖杀各实验组小鼠, 50%乙醇灌肠小鼠结肠未见充血水肿;TNBS模型组小鼠结肠明显充血水肿,有散在小溃疡形成;虫卵免疫结肠炎组小鼠则无充血水肿,结肠表面光滑。镜下,TNBS模型组小鼠肠壁明显增厚,组织上皮破损,炎性渗出,大量白细胞浸润并伴明显组织坏死,腺体结构部分消失;虫卵免疫的结肠炎小鼠则炎症较轻,黏膜结构完整。给予虫卵和未给予虫卵的结肠炎小鼠组织学分级分别为3.6±0.49和1.6±0.70 (P<0.0005)。小鼠经TNBS诱导后,Th1类细胞因子IFN-γ水平为3.47±0.87 ng/ml, Th2类细胞因子IL-4水平为146.06±45.76 pg/ml。预先经虫卵免疫的结肠炎小鼠则炎症得到明显控制,症状较轻,体重恢复较快,且IL-4水平显著升高至598.50±135.90 pg/ml而IFN-γ表达被明显抑制其水平为1.53±0.51 ng/ml。结论本研究首次证实日本血吸虫卵对TNBS诱导的小鼠结肠炎具有保护作用。二、日本血吸虫卵对TNBS诱导的小鼠结肠炎保护作用机制的研究目的探讨日本血吸虫卵对小鼠溃疡性结肠炎保护作用的免疫调节机制。方法40只6～8周龄雌性BALB/c小鼠,随机分组,10只/组,分为PBS对照组、血吸虫卵免疫对照组、TNBS诱导的结肠炎组和虫卵免疫后TNBS诱导的结肠炎组。将虫卵悬于100μl pH 7.4 PBS中,以10 000个虫卵/鼠分别于第0、7、14和21 d经腹腔注射免疫小鼠,对照组小鼠给予等体积PBS。末次免疫后第5 d,小鼠禁食24 h,自由饮水。乙醚轻度麻醉后,用直径2 mm的灌肠器从肛门插入结肠约4 cm处,实验组小鼠注入2% TNBS 0.1 ml,对照组注入等体积的生理盐水,使灌注液能够到达盲肠,并保持小鼠垂直状态约30 s。诱导结肠炎后第6 d剖杀小鼠,无菌取脾,制备淋巴细胞悬液,调整细胞数至3×106/ ml。将小鼠脾淋巴细胞悬液加至24孔培养板中,1 ml/孔,每孔分别加Con A 5μg/ml,双抗(青霉素和链霉素) 100 U/ml,置37℃, 5 % CO2培养箱,72 h后离心取上清液,用ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL- 4、IL- 5和IL- 10水平。取上述各组1×106脾细胞,用流式细胞术检测脾细胞中CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ T细胞亚群水平。结果未经虫卵免疫的小鼠经TNBS诱导后结肠炎症状明显,细胞因子IFN-γ水平高达3.47±0.87 ng/ml,IL-4、IL-5和IL-10水平则较低分别为146.06±45.76 pg/ml, 140.32±39.01 pg/ml, 385.91±134.89 pg/ml;经虫卵免疫的结肠炎小鼠的炎症得到明显控制,IFN-γ表达被明显抑制其水平为1.53±0.51 ng/ml,IL-4、IL-5和IL-10水平显著升高分别为598.50±135.90 pg/ml, 217.86±77.82 pg/ml, 799.651±197.93 pg/ml。经虫卵免疫的结肠炎小鼠脾脏CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ T细胞亚群比例为3.55±0.81%显著高于未免疫组结肠炎小鼠的2.31±0.39%。结论:1.首次确定了日本血吸虫卵对TNBS诱导的结肠炎小鼠有保护作用,在TNBS诱导小鼠结肠炎之前给予日本血吸虫卵,可以升高Th2类细胞因子IL- 4、IL- 5以及IL- 10的水平,抑制过度的Th1反应及引起的炎症反应;2.首次证实日本血吸虫卵对TNBS诱导的结肠炎小鼠的保护作用与CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ T细胞有关; 3.提示诱生抗原特异性调节性T细胞可能成为治疗自身免疫性疾病的一条新途径,为变害为利,进一步开发利用寄生虫资源奠定了基础。