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本研究分为以下几个部分:1.从戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)IgG检测阳性的新疆羊场采集54份羊粪便,利用逆转录套式聚合酶链方法(RT-nPCR),检测HEV RNA,其中6份为阳性,阳性率为11.11%。将PCR扩增产物克隆、测序并进行序列分析,结果表明,6株羊源HEV检测株在HEV ORF2 189bp 99.38%-100%,为同一基因型;与HEV I、II、III、Ⅳ的同源性分别为78.67%-85.33%、81.33%-82.67%、78.67%-84.00%和84.67%-95.36%,与Ⅳ型最高同源性达94.04-95.36%。以该189bp片段绘制进化树,发现与新疆牛源分离株、中国大陆猪源分离株(FJ610232)和中国大陆人源分离株(AJ272108)在同一分枝上,同属基因Ⅳ型;提示新疆羊群中可能存在HEV感染,并且羊可能是人类HEV传染源中除猪之外的另一宿主。
2.本试验对pET28a-ORF2-62质粒进行酶切,回收得到ORF2-62片段,把该片段插入pET-32a,构建了pET32a-ORF2-62原核表达载体。通过酶切和测序鉴定,得到读码框正确的阳性重组质粒,将此重组质粒转化DE3,经不同IPTG终浓度、诱导时间进行诱导表达,结果表明,IPTG的浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导4 h表达量最大。经SDS蛋白电泳和Western blot证明其具有反应原性,通过纯化重组蛋白达到0.308 mg/ml,为HEV ORF2-62蛋白的免疫学特性研究及应用奠定了基础。
3.利用已建立的表达条件,以纯化后的重组蛋白pET32a-ORF2-62作为抗原,使用HEV阴、阳血清确定二抗浓度以及抗原浓度。经方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为7.7 ug/ml,血清最佳稀释比为1:40,酶标二抗的工作浓度为1:3000。该方法与其它阳性血清不发生交叉反应,表明具有良好的的特异性,通过对比试验检测其敏感性。试验结果表明此方法检测羊戊型肝炎病毒的血清具有良好的特异性、敏感性和稳定性,与万泰公司生产的戊型肝炎病毒抗体诊断试剂盒检测羊血清的符合率达90%。此方法的建立为戊型肝炎早期诊断提供了一种快速简便的血清学诊断方法。