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脑卒中是一种常见的疾病,绝大多数脑卒中病例是由短暂性或永久性脑血管闭塞引起的缺血性脑血管病(缺血性中风)最终导致脑梗死。缺血性中风是一种高度复杂和异质性的疾病,缺血后兴奋性毒性氨基酸的释放,炎性因子、趋化因子的释放等,都会对神经元产生二次损伤。星形胶质细胞做为脑内大量存在的细胞,是中枢神经系统重要的管家细胞,其在神经兴奋时清除多余的兴奋性递质、控制离子和水分子动态平衡、释放神经营养因子、转移代谢产物和废弃物、参与血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)形成、调控局部脑血流等方面有重要作用。因此,探讨星形胶质细胞在缺血性脑血管病中的作用,探索有效中药对其的作用机制,对防治脑血管疾病具有一定的意义。目的:整体与细胞水平,探讨缺血缺氧状态下星形胶质细胞过度增殖、神经递质的传递、炎性反应及LCN2蛋白诱导的相关信号通路的相关性;在此基础上,探讨中药复方SLT及其部分有效成分对星形胶质细胞相关功能的干预作用与相关机制的研究。方法:第一部分——SLT治疗急性期多发性脑梗死大鼠的作用机制研究——采用大鼠微球法至多发性脑梗死实验模型,通过神经行为评分、透射电镜观察星形胶质细胞超微结构、HE染色观察病理学形态评价SLT对皮层区损伤的保护作用;根据组织内及血清内炎性因子的表达,以及qPCR、免疫荧光、免疫印迹观察星形胶质细胞的活化、特异蛋白LCN2及其诱导的JAK2\STAT3信号通路的变化,以考察脑缺血损伤后星形胶质细胞的活化与炎性反应的关系及SLT对缺血损伤皮层区星形胶质细胞功能的影响。第二部分——SLT治疗恢复期多发性脑梗死大鼠的作用机制研究——采用大鼠微球法至多发性脑梗死实验模型,依据前期结果,首先通过microRNA基因组学评价恢复期脑梗死大鼠缺血侧大脑组织内microRNA的变化,根据前期急性期结果寻找相关的靶基因、相关通路以及SLT可能的作用靶点;其次通过Morris水迷宫实验评价SLT对恢复期大鼠空间记忆功能障碍的影响;随后,根据组织内及血清内炎性因子的表达,以及qPCR、免疫荧光、免疫印迹观察星形胶质细胞的活化、特异蛋白LCN2及其诱导的JAK2\STAT3信号通路的变化,以考察恢复期脑缺血损伤后星形胶质细胞的活化与炎性反应的关系及SLT对恢复期缺血损伤皮层区星形胶质细胞功能的影响。第三部分——SLT及主要有效成分抗HA细胞缺氧复氧损伤机制研究——选择SLT及主要活性成分银杏叶总提物进行细胞水平的研究。首先建立人星形胶质细胞——Human Astrocyte细胞培养体系,通过CCK8法考察二者对正常培养HA细胞活力的影响;随后,依据前期基础及参考文献建立HA细胞糖氧诱导(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤模型,并采用慢病毒转染的方法过表达目的基因LCN2,检测细胞分泌炎性因子含量变化,免疫荧光、蛋白免疫印迹观察星形胶质细胞的活化、特异蛋白LCN2及其诱导的JAK2\STAT3信号通路的变化,考察星形胶质细胞损伤后SLT有效成分对其的影响。结果:在第一部分实验中,我们观察到如下结果:与模型组相比,SLT可显著降脑缺血大鼠神经行为评分的分值,银杏叶提取物亦能降低脑缺血大鼠神经行为评分的分值,但较SLT组分值略高;SLT可有效减轻星形胶质细胞的活化及增殖,SLT组缺血侧病变减轻,皮层神经元少量变性,核固缩和核溶解程度减轻,神经元的凋亡与坏死受到抑制,较为明显改善脑脑缺血损伤大鼠皮层缺血周边半暗带区神经元及突触超微结构损伤;SLT可抑制缺血侧皮层区及血清内炎性因子及趋化因子的表达,根据免疫荧光与免疫印迹的结果看出,SLT可能通过抑制LCN2诱导的JAK2/STAT3信号通路的表达来抑制炎性反应。在第二部分试验中,首先我们发现,对于脑缺血恢复期大鼠,SLT可减少部分缺血侧组织的microRNA差异,并可预测到与LCN2-JAK2/STAT3通路有关;其次,SLT及银杏叶提取物可显著降低脑缺血引起的大鼠空间记忆认知功能障碍,与急性期结果相似,SLT可有效减轻星形胶质细胞的活化及增殖,SLT组缺血侧病变减轻,皮层神经元少量变性,核固缩和核溶解程度减轻,神经元的凋亡与坏死受到抑制,较为明显改善脑脑缺血损伤大鼠皮层缺血周边半暗带区神经元及突触超微结构损伤;SLT可抑制缺血侧皮层区及血清内炎性因子及趋化因子的表达,根据免疫荧光与免疫印迹的结果看出,SLT可能通过抑制LCN2诱导的JAK2/STAT3信号通路的表达来抑制炎性反应。第三部分实验中,细胞水平结果与整体水平结果互相印证,SLT与EGB阻断了 OGD诱导的星形胶质细胞内JAK2/STAT3的激活和炎性因子的生成,而LCN2的过度表达显著增强了这些效应;SLT与EGB下调了 LCN2过表达增强的这些效应。结论:(1)缺血缺氧损伤后,星形胶质细胞过度活化增殖,从而诱导一系列的炎性反应,并激活LCN2诱导的JAK2/STAT3信号通路;(2)SLT及其有效成分可能以LCN2为靶点,抑制星形胶质细胞的活化,从而抑制进一步的炎性反应,以达到治疗缺血性脑血管病的目的。