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猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2),是一种重要的人兽共患病病原。感染猪临床表现为脑膜炎、关节炎、败血症等病症,且能感染人,引发心内膜炎、关节炎、败血性休克等疾病,严重可导致死亡。1998年和2005年,我国江苏和四川分别发生了人的猪链球菌2型感染,给公共卫生带来重大威胁。猪链球菌2型致病与细菌黏附、侵袭呼吸道上皮细胞或血管内皮细胞,抗吞噬细胞的吞噬及激活免疫细胞炎症反应等密切相关。研究显示,猪链球菌表面蛋白能够与人血清中的补体负调节因子相结合,以逃避人体免疫细胞的吞噬,从而增强其在血液中的存活能力；猪链球菌2型抗巨噬细胞吞噬的成分有荚膜多糖、肽聚糖脱乙酰酶蛋白、超氧化物歧化酶等。本实验室前期研究发现,超氧化物歧化酶Superoxide dismutase-SodA是猪链球菌2型的重要毒力因子,可清除超氧根离子,增强细菌抗氧化应激的作用。新发现原核生物的丝氨酸/苏氨酸激酶和磷酸酶与其对环境抗性、对毒力因子表达调控和对宿主的致病性紧密相关。本研究目的：(1)初步解析sodA缺失提高猪链球菌2型黏附细胞的机制；(2)探明猪链球菌2型SodA减轻细胞自噬的机制；(3)以小鼠为模型初步探明丝氨酸/苏氨酸磷酸酶Stp1在猪链球菌2型致病中的作用。1.猪链球菌2型SodA介导对细胞的黏附,减轻小鼠巨噬细胞自噬sodA基因缺失株对细胞黏附率显著地高于亲本株：△sodA株对血管内皮细胞黏附率为22.6‰,而亲本株为0.3‰(p<0.01)；△sodA株对HEp-2细胞黏附率为21.3‰,而亲本株为0.4‰(p<0.01)。小鼠巨噬细胞RAW264.7, sodA缺失株被吞噬率显著地高于亲本株(15.71% vs 0.67%,p<0.01)。为探究sodA基因缺失对细胞黏附提高的机制,对猪链球菌2型细菌野生株和sodA缺失株进行了细菌表面蛋白的二维电泳分离,选择了6个表达差异较大的点进行质谱鉴定及对相应蛋白mRNA荧光定量分析,结果显示sodA缺失株硫氧还蛋白mRNA转录水平显著高于亲本株。为探究其机制,原核表达了猪链球菌的硫氧还蛋白Thioredoxin-1和Thioredoxin-2,并制备了相应的兔源多抗。通过提取细菌表面蛋白进行验证,发现sodA基因缺失对Thioredoxin-1表达影响不显著,而Thioredoxin-2表达显著上升,故推测Thioredoxin-2可能介导了sodA缺失株的黏附上升。前期研究表明,猪链球菌2型sodA缺失株在巨噬细胞中抗吞噬和杀菌能力显著下降,提示SodA可能通过降低ROS对菌体的损伤,有利于其存活。为探究SodA对猪链球菌2型感染小鼠巨噬细胞自噬的影响及其机制,以感染比(MOI)100:1,将猪链球菌2型野生型(WT)与sodA缺失株(△sodA)感染稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞。激光共聚焦分析显示△sodA感染的细胞中LC3-II-GFP荧光斑点数显著高于野生型菌株(p<0.01)；用溶酶体标记分子Lysortrack进行跟踪,溶酶体与LC3-II-GFP分子的共定位；免疫印迹检测自噬标记分子LC3-Ⅱ/Ⅰ表达差异,灰度比结果显示△sodA相对亲本株更早促进细胞自噬；△sodA株在感染细胞1小时LC3-Ⅱ的表达量显著高于亲本株(p<0.01),亲本株在感染2小时后才出现LC3-Ⅱ的表达量上调。为了探明sodA缺失菌影响细胞自噬的机制,采用检测超氧根离子的探针分子二氢乙锭(Dihydroethidium-DHE)及检测过氧化氢探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(dihydrodichlorofluorescein diacetate-H2DCF-DA),用流式细胞仪检测细菌感染RAW264.7细胞1小时和2小时后细胞内的ROS变化。结果显示,△sodA株细胞内ROS的量显著高于野生菌株(p<0.05),而细胞内H202的变化差异不显著。且sodA缺失株,在百草枯中相对亲本株,生长速度变慢。大肠杆菌表达的猪链球菌2型SodA蛋白,具有催化活性,可快速清除体外黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶体系产生的ROS。因此,猪链球菌2型可能利用SodA降低感染细胞内的ROS,从而延缓细胞自噬。2.猪链球菌2型Stp1具有去磷酸化作用,介导对小鼠的致病性stp1是猪链球菌2型编码丝氨酸/苏氨酸去磷酸酶的基因,该酶是依赖金属离子的水解酶,进行去磷酸化反应。为了研究stp1基因在猪链球菌2型致病中的作用,利用同源重组方法构建了stp1基因缺失株,分析stp1基因缺失对细胞黏附和小鼠致病力的影响。结果显示,缺失stp1基因(△stp1)对于bEnd.3和HEp-2细胞的黏附能力显著上升,△stp1对bEnd.3细胞粘附率为1.9‰,而亲本株为03‰(p<0.01), HEp-2细胞相应的粘附率分别为1.92‰和0.40‰(p<0.05)。△stp1在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的存活率相对于亲本株显著上升(0.79% vs0.16%,p<0.05)。在含百草枯(20mM)的培养基中,△stp1的抗氧化应激能力显著高于亲本株(p<0.01)。Astp1对小鼠的毒力试验显示,LD50升高1.8倍;stp1缺失株在小鼠脏器中的细菌载量显著降低(p<0.01),表明缺失stp1细菌毒力显著下降。用抗丝氨酸抗体检测了二维电泳胶中亲本株与△stp1缺失株蛋白表达水平差异,结合质谱技术分析发现Stp1可调控10个蛋白点的磷酸化。而体外磷酸化显示,Stp1对已知底物pNPP具有去磷酸化作用,但对SodA的去磷酸化作用不显著,有待进一步改善方法加以证实。综上所述,本研究首次证实缺失sodA基因可增强猪链球菌2型对细胞的黏附能力,且该菌可利用SodA清除巨噬细胞内超氧根离子的量进而延缓细胞自噬；Stp1蛋白在猪链球菌2型中是个重要的磷酸酶,缺失stp1基因可影响细菌的黏附能力、细胞内的存活率和小鼠毒力。上述研究结果可为深入探索猪链球菌2型的致病机制提供一定的基础。