目的：初步分析早期乳腺癌患者化疗前、后，随着白细胞总数下降，外周血B细胞受体库多样性、克隆性和组成特征等变化，以及患者在应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）辅助治疗后，白细胞总数恢复并拟开始下一个化疗前，外周血 B细胞受体库相应变化特征，为早期乳腺癌患者化疗前、后B细胞受体库动态变化及GM-CSF治疗对B细胞受体库的影响提供基础的分析评估数据和监测技术。　　方法：　　（1）从临床住院治疗的早期乳腺癌患者中，根据以下条件采集15例志愿患者外周血：采用21天为一个周期的6期TAC（T：多西他赛；A：吡柔比星；C：环磷酰胺）化疗方案；符合化疗前外周血白细胞数目大于3.0×10^9/L（SX-1），第3期化疗后白细胞数目小于2.5×10^9/L（SX-2），第3期化疗后应用GM-CSF后白细胞数目大于5.0×10^9/L（SX-3）；每次采集早期乳腺癌志愿患者外周血5ml。　　（2）从临床15例早期乳腺癌志愿患者中筛选3例志愿者S1，S2，S3（“S”代表样本“sample”；“-1”“-2”“-3”代表化疗前、化疗后、GM-CSF治疗后三个不同时间点），从每个时间点采集的5ml外周血中，分离PBMC，提取总DNA。　　（3）各 DNA样本，浓度和纯度鉴定符合建库和测序要求后，由美国 Adaptive Biotechnologies Immuno SEQ公司采用多重PCR构建人BCR H-CDR3（Heavy chain complementarity determining region3，H-CDR3）组库，采用Illumina Solexa技术测序人BCR H-CDR3受体组库。　　（4）B细胞 H-CDR3受体库多样性、克隆性和组成特征分析：美国immuno SEQ公司高通量测序所得原始“tsv.文件数据”运行VBA程序转换为“fasta.文件数据”格式后，上传IMGT数据库，IMGT数据库运用在线High V-QUEST分析软件，所获“IMGT summary序列数据文件”，应用excel2010按照以下原则对9个样本原始数据进行分类筛选：No results；Unknow；Warings；Productive；Unproductive；V基因为假基因；CDR3区AA junction序列的5端104位点非半胱氨酸和3端118位点非色氨酸。应用原始数据筛选后的Productive序列数据，对B细胞H-CDR3受体库从H-CDR3克隆水平、IGHV基因取用水平、H-CDR3氨基酸构成等方面进行分析和基本数据统计以及储存，利用venn diagram分析软件对克隆重叠率进行分析，GraphPad Prism5软件绘图。　　（5）对比分析每一例患者三个时间点B细胞H-CDR3受体库变化特征，以及不同个体间B细胞H-CDR3受体库变化特征。　　结果：　　（1）TAC化疗治疗前，3例早期乳腺癌志愿患者淋巴细胞比例以及淋巴细胞绝对值均在正常值范围内；第3期TAC化疗后，淋巴细胞比例虽然正常，但淋巴细胞绝对值下降；第3期TAC化疗后使用GM-CSF，尽管白细胞总数（WBC）显著升高，但淋巴细胞比例却是降低的，但因WBC明显升高，淋巴细胞绝对值总体是升高的。　　（2）3例早期乳腺癌化疗志愿患者三个不同时间点高通量测序BCR H链V区总序列中功能序列数目分别为：S1-1：85897，S1-2：76610，S1-3：57409；S2-1：135494，S2-2：98565，S2-3：101174；S3-1：22746，S3-2：99418，S3-3：32027。　　功能性独特序列数目分别为：S1-1：6744，S1-2：7999，S1-3：8329；S2-1：13663，S2-2：9538，S2-3：13855；S3-1：6187，S3-2:13338，S3-3：6963。　　其中，功能性独特序列占功能性总序列比例分别为：S1-1：7.85％，S1-2：10.44%，S1-3：14.51%；S2-1：10.08%，S2-2：9.68%，S2-3：13.69%；S3-1：27.20%，S3-2：13.42%，S3-3：21.74%。　　（3）3例早期乳腺癌化疗志愿患者不同时间点的反辛普森指数（1/Ds）分别为S1-1=4626，S1-2=5451，S1-3=6151；S2-1=9950，S2-2=7006，S2-3=10702；S3-1=421，S3-2=178，S3-3=291。　　（4）3例早期乳腺癌化疗志愿患者三个不同时间点均出现 IGHV3-11、IGHV3-23、IGHV3-30亚基因家族的优势取用，其中S1，S2患者同时存在IGHV4-30-2、IGHV4-34亚基因家族高取用，S3患者则表现为IGHV5-10-1基因高取用。　　（5） S1患者化疗3个疗程后IGHV2-10、IGHV3-22、IGHV5-78基因取用丢失，使用GM-CSF后重新出现。GM-CSF治疗后相比于治疗前，出现2个基因 IGHV3-25（0.0052%）、IGHV3-38（0.0069%）新的低频表达。S2患者化疗3个疗程后IGHV3-19、IGHV3-38-3基因取用丢失，使用GM-CSF后重新出现。GM-CSF治疗后相比于治疗前，出现1个基因IGHV3-38（0.0020%）新的低频表达。S3患者化疗3个疗程后出现IGHV3-52（0.0201%）、IGHV3-71（0.0624%）、IGHV4-28（0.0030%）基因的取用现象，而IGHV3-35、IGHV3-9基因则发生取用丢失；GM-CSF使用后 IGHV1-45、IGHV3-19、IGHV4-30-4基因取用丢失；其中 IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV5-78基因在化疗后出现，GM-CSF使用后丢失。　　（6）3例早期乳腺癌志愿患者三个时间点检测3例志愿患者 BCR H-CDR3受体库IGHV-IGHJ基因取用和配对没有发生明显改变，并且3例志愿患者存在共同的优势配对（>2.0%）参与V-J基因有效重排过程，即：IGHV3-11—IGHJ4、IGHV3-11—IGHJ6、IGHV3-23—IGHJ4、IGHV3-30—IGHJ4、IGHV3-30—IGHJ6。　　（7）9个样本不同时间点的BCR H-CDR3克隆重叠率分别为 S1-1&S1-2=2.08%，S1-1&S1-3=2.20%，S1-2&S1-3=1.82%；S2-1&S2-2=0.33%，S2-1&S2-3=0.55%，S2-2&S2-3=0.57%；S3-1&S3-2=0.29%，S3-1&S3-3=0.24%，S3-2&S3-3=0.26%　　（8）BCR H-CDR3氨基酸（AA）组成分析显示，3例早期乳腺癌志愿患者H-CDR3相同位点氨基酸长度和构成均相似，S1患者H-CDR3氨基酸长度呈14AA的标准钟形分布，S2，S3患者氨基酸长度则出现以15AA为主的标准钟形分布情况，且H-CDR3两端氨基酸取用保守，分别为105位点丙氨酸、106位点精氨酸、115位点苯丙氨酸、116位点天冬氨酸、117位点酪氨酸，其中H-CDR3高取用氨基酸为甘氨酸、亲水性的天冬氨酸和丝氨酸、疏水性的酪氨酸。　　结论：　　（1）TAC化疗药物能够损伤特异性免疫系统，并且患者化疗后相比于化疗前 BCR CDR3库多样性（1/Ds）有所下降，GM-CSF治疗后3例志愿患者BCR CDR3库多样性（1/Ds）增多，提示化疗药物对B细胞CDR3库多样性有损伤作用，而应用GM-CSF可促进其多样性恢复。　　（2）化疗能使乳腺癌患者出现IGHV基因取用丢失，GM-CSF治疗后出现IGHV3-25、IGHV3-38基因新的低频表达，提示化疗药物和GM-CSF可能对B细胞IGHV基因取用和表达产生了影响。　　（3）3例早期乳腺癌化疗志愿患者三个不同时间点IGHV-IGHJ基因家族取用和配对存在优势配对（>2.0%）现象，可能与乳腺癌抗原诱导相关。同时，9个样本不同时间点的BCR H-CDR3克隆重叠率很低。　　（4）3例早期乳腺癌志愿患者三个不同时间点的unique H-CDR3区氨基酸取用没有发生明显改变，进一步分析发现氨基酸构成等未发生改变，没有发现具有明显偏向性的克隆序列，提示GM-CSF可能以动员骨髓初始B细胞为主，而不是单一刺激外周某一类型记忆性B细胞增殖。