背景:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）感染是人类最常见的细菌感染之一,据统计,全球约一半的人口感染Hp。Hp是一种革兰阴性微需氧菌,这种细菌通过改变环境,降低酸度而专门寄生于人类胃中。Hp感染不但可以导致慢性活胃炎、胃十二指肠溃疡、腺癌等胃良恶性疾病,而且还可引起胃以外的众多疾病。另外,Hp感染与胃食管反流、功能性消化不良、胃排空障碍等功能性胃肠病相关性的研究亦不断报道。Hp感染对胃排空功能影响的研究争论己久,但仍未得到确切结论。Hp感染对胃排空功能的影响及相关机制的研究,对于Hp感染患者手术后发生胃排空延迟（delayed gastric emptying,DGE）的预测及治疗,以及Hp相关胃肠动力障碍性疾病的研究均具有重要意义。既往的研究多为临床实验,仅阐明了Hp感染对胃排空功能的影响,对其相关机制研究甚少。且临床实验影响因素复杂,研究对象存在不可预知的个体差异,因此动物实验是更为理想的选择。胰十二指肠切除术（Pancreatoduodenectomy,PD）是肝胆外科用于治疗胰头及壶腹周围良恶性疾病的重要手术方式。DGE是PD术后最常见的并发症之一。PD术后DGE的危险因素除了术后胰瘘、腹腔内感染等相关因素外,Hp感染是否为DGE的新的危险因素呢?胃肠的正常运动功能有赖于胃肠激素、内源性和外源性肠神经系统、卡哈尔间质细胞（interstitial cells of Cajal,ICCs）以及胃肠平滑肌之间的相互协调作用。当胃肠激素水平的改变、内源性或外源性肠神经系统的病变,卡哈尔间质细胞的数量或功能的改变,以及胃肠平滑肌疾病均可导致胃排空障碍。ICCs被认为是胃肠道运动的起搏器,在胃肠道运动中发挥重要的作用。而平滑肌被认为是胃肠道运动的最终效应器。因此,本课题中我们构建了 Hp感染的小鼠模型,明确了 Hp感染对胃排空功能的影响,并从胃肠道ICCs和胃肠平滑肌这两方面探究Hp感染影响胃排空功能的相关机制,同时通过对胰十二指肠切除术患者的临床病例进行分析研究,探索本课题在临床工作中的意义。第一部分:Hp感染对胃排空功能的影响研究目的:明确Hp感染对胃排空功能的影响。研究方法:1.微需氧环境下培养Hp悉尼株（HpSS1）。2.购买70只SPF级雌性C57BL/6小鼠。随机选取40只小鼠,通过灌胃的方法建立Hp感染的小鼠模型,建模成功的小鼠作为实验组（Hp+组）。另外30只小鼠作为对照组（Hp-组）。3.6w后,用灌胃针将40粒直径0.4mm胶珠送入小鼠胃中,1小时后处死小鼠,留取胃组织,清点胃内胶珠数目,计算胃排空率:胃排空（%）=（40-胃内胶珠数）/40×100。4.建模成功的鉴定方法:1.胃粘膜快速尿素酶实验2.胃粘膜细菌培养行生化实验鉴定（尿素酶试验、触酶试验、氧化酶试验）3.胃组织免疫组化（抗Hp抗体）5.在建模成功且灌胃针内没有胶珠的小鼠中随机选取12只作为实验组（HP+组）,另外30只小鼠灌胃针内没有胶珠的小鼠中随机选取12只作为对照组（HP-组）,用于计算胃排空及后续实验。研究结果:1.用于建模的40小鼠,有2只在第1次灌注幽门螺杆菌时死亡,余小鼠均存活至实验结束,有35只小鼠建模成功,建模成功率约为92%。另外30只对照组小鼠均存活至实验结束。2.Hp+组小鼠胃排空率为65.8±5.6%,Hp-组小鼠胃排空率为83.8±6.4%。Hp+组小鼠的胃排空率低于Hp-组,差异具有统计学意义（p＜0.05）。研究结论:通过灌胃的方法建立Hp感染的小鼠模型方法可行。Hp感染影响胃排空功能,使胃排空减慢。第二部分:Hp感染通过减少ICCs引起DGE的机制研究目的:Hp感染通过减少ICCs引起DGE的机制。研究方法:1.通过HE染色观察两组小鼠胃粘膜炎症情况。2.应用qPCR检测两组小鼠胃组织中miR-222的表达水平。3.应用免疫组化分别测定两组小鼠胃组织中平滑肌层和粘膜下层的ICCs的数目。4.应用western blot测定两组小鼠胃组织中干细胞因子（stem cell factor,SCF）的蛋白表达情况,并与内参GAPDH做标准化对比。研究结果:1.两组小鼠胃粘膜未见明显差异。2.两组小鼠胃组织中miR-222的表达具有显著差异。与Hp-组小鼠相比,Hp+组小鼠胃组织中miR-222的表达显著上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）3.Hp感染后,小鼠胃组织平滑肌层及粘膜下层ICCs数目均明显减少。Hp+组和Hp-组小鼠胃组织平滑肌层ICCs数目分别为3.32±1.60 vs 5.52±2.17（P＜0.05）。Hp+组和Hp-组小鼠胃组织粘膜下层ICCs数目分别为6.29±2.46 vs 14.00±5.18（P＜0.05）。4.Hp+组小鼠胃组织SCF/GAPDH 比值为0.52±0.19,Hp-组小鼠胃组织SCF/GAPDH比值为0.69±0.19。Hp+组小鼠胃组织SCF的表达水平显著低于HP-组小鼠（P＜0.05）。研究结论:Hp除了通过上调小鼠胃组织中miR-222导致胃组织中ICCs数目减少外,还可通过使小鼠胃组织中SCF蛋白表达下降导致胃组织中ICCs数目减少,从而引起 DGE。第三部分:Hp感染通过影响胃平滑肌引起DGE的机制研究目的:Hp感染通过影响胃平滑肌引起DGE的机制。研究方法:1.随机抽取Hp+组和Hp-组小鼠胃组织标本各4例,应用蛋白组学筛选出差异表达的蛋白。应用microRNA（miRNA）芯片筛选出差异表达的miRNA,在差异表达的蛋白中查找与胃排空功能相关蛋白的基因作为靶基因,应用靶基因预测软件（Targetscan）在差异表达的miRNA中筛选出与靶基因具有负调控关系的miRNA作为目标miRNA。2.应用qPCR检测两组小鼠胃组织中目标miRNA及靶基因mRNA的表达水平。应用Western blot检测两组小鼠胃组织中靶基因的蛋白表达水平。3.应用荧光素酶报告基因检测验证目标miRNA对靶基因具有直接调控关系。4.应用Western blot检测两组小鼠胃组织中靶基因表达蛋白下游因子的蛋白表达水平。研究结果:1.通过蛋白组学及miRNA芯片的检测,应用靶基因预测软件（Targetscan）筛选出与胃排空功能相关的蛋白,其基因即靶基因为肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase,MLCK/MYLK）,调控 MLCK 的 miRNA 有 miR-1894-3p,miR-24-3p,miR-365-3p,miR-7018-5p。2.两组小鼠胃组织中miR-1894-3p,miR-365-3p的表达均无显著差异（P＞0.05）。而两组小鼠胃组织中miR-24-3p,miR-7018-5p的表达具有显著差异。与Hp-组小鼠相比,Hp+组小鼠胃组织中miR-24-3p,miR-7018-5p的表达显著上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。两组小鼠胃组织中MLCK mRNA水平无显著差异（P＞0.05）。而两组小鼠胃组织MLCK蛋白水平有显著差异。与Hp-组小鼠相比,Hp+组小鼠胃组织中MLCK的表达显著下调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.双荧光素酶报告基因检测显示:miR-7018-5p与MLCK不具有直接调控关系,而miR-24-3p与MLCK具有直接调控关系。4.两组小鼠胃组织中肌球蛋白轻链（MLC20）磷酸化水平具有显著差异。与Hp-组小鼠相比,Hp+组小鼠胃组织中MLC20磷酸化水平显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。研究结论:Hp感染通过上调小鼠胃组织中miR-24-3p,致MLCK蛋白表达下调,MLC20磷酸化水平降低,使胃排空减慢。第四部分:Hp感染对PD术后胃排空功能影响的临床病例分析研究目的:1.Hp感染是否为PD术后DGE的危险因素。2.Hp感染影响胃排空功能相关机制的临床病例验证。研究方法:1.收集134例PD患者的临床病理资料,分为非DGE组和DGE组。应用胃组织免疫组化确定患者幽门螺杆菌的感染情况,分析非DGE组和DGE组患者的临床病理特征。2.采用Logistic回归分析影响PD术后发生DGE的危险因素。3.随机选取Hp+组及Hp-组患者胃组织石蜡标本各12例,应用qPCR检测两组患者胃组织中miR-222及miR-24-3p的表达水平。应用免疫组化测定两组患者胃组织中平滑肌层和粘膜下层的ICCs的数目以及MLCK蛋白的表达。研究结果:1.本研究134例PD患者中,34例（约25%）术后发生DGE。DGE组患者临床资料与非DGE组患者比较发现,两组在基线资料如年龄、性别等方面差异无统计学意义。但DGE组患者Hp感染及腹腔感染比例明显增高。2.单因素分析结果显示,Hp感染及腹腔感染是PD术后发生DGE的潜在危险因素。将上述因素纳入多因素分析结果显示,除腹腔感染这一手术相关因素外,Hp感染亦是PD术后发生DGE的独立危险因素。3.Hp+组与Hp-组患者胃组织中miR-222,miR-24-3p的表达具有显著差异。与Hp-组相比,Hp+组患者胃组织中miR-222,miR-24-3p的表达显著上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与Hp-组相比,Hp+组患者胃组织平滑肌层及粘膜下层ICCs数目均明显减少。Hp+组和Hp-组患者胃组织平滑肌层ICCs数目分别为 33.3±14.5 vs 55.0±16.4（P＜0.05）。Hp+组和 Hp-组患者胃组织粘膜下层 ICCs数目分别为20.9±10.0 vs 30.2±9.2（P＜0.05）。与Hp-组相比,Hp+组患者胃组织MLCK的表达明显减少。Hp+组和Hp-组患者胃组织MLCK免疫组化染色评分分别为5.1±1.9 vs 8.9±1.7（P＜0.05）研究结论:Hp感染是PD术后发生DGE的独立危险因素。与动物实验一致,Hp可通过上调miR-222导致胃组织中ICCs减少,从而增加了 PD术后DGE的发生风险。另外,Hp可通过上调miR-24-3p致胃组织中MLCK表达下调,从而增加了 PD术后DGE的发生风险。