马铃薯病毒多重RT-PCR检测和PVS(内蒙分离株)部分序列的测定

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马铃薯是一种分布广泛、适应性强、营养丰富的粮菜兼用型作物之一,现已证明马铃薯病毒的感染是引起马铃薯退化的主要原因。生产上常见的有PVY、PLRV、PVX、PVA、PVS以及PSTVd,其中PVY和PLRV是全世界范围内马铃薯上危害最严重的病毒。   目前生产上解决由马铃薯病毒侵染所导致的马铃薯品质下降和减产的主要对策就是培育种植脱毒种薯,而截止到2008年,我国脱毒马铃薯的应用面积还不足总面积的20%。为了确保马铃薯原原种、原种的脱毒质量,准确鉴定种薯感染的病毒种类,建立一种快速、简便和特异性强的病毒检测方法已成为马铃薯生产中迫切需要解决的问题。   本试验中,PVY、PVS和PLRV检测所用的引物是根据各个国家和地区已发表的相应病毒的外壳蛋白(CoatProtein,CP)基因的保守序列来进行设计,PVY、PVS和PLRV的目的产物长度分别为781bp、181bp和364bp。各种病毒的RNA样品,经扩增后均能得到一条与目的片段大小相近的产物条带;将三种病毒的产物进行测序,并将其同已发表序列进行比对,发现各种病毒的产物序列与相应的已发表序列均具有高度的同源性,从而说明了扩增产物及为目的产物。   试验设置的阳性对照是以健康马铃薯总RNA为模板,参照马铃薯18SrRNA的基因设计扩增所用引物,其RNA样品经扩增后均能得到一条长为255bp的目的产物;以健康马铃薯RNA为模板,分别经三种病毒的引物扩增后的产物,经电泳检测时没有任何产物条带,说明设计的各种病毒的引物不扩增马铃薯的基因。   取相同提取量(0.4g)的带毒马铃薯材料,分别用RT-PCR法和ELISA法进行检测,并对两种方法的灵敏度进行了灵敏度的比较。比对结果发现,RT-PCR检测法的灵敏度达到了Pg甚至fg级别,而ELISA检测灵敏度为mg或ug,从而说明RT-PCR检测的灵敏度优于ELISA。   本试验通过对RT-PCR反应条件进行优化,试探出一种能够同时扩增PVY、PVS和PLRV的反应体系和反应条件,能较好地指示马铃薯材料是否感染PVY、PVS或PLRV以及确定感染的病毒种类。   另外,根据(NC_007289)和(AJ863509和AJ863510)的PVS全序列分段设计了五对引物,扩增后得到了长度分别为1777bp、1806bp、2316bp、1294bp和1310bp的片段。将扩增片段连接载体并转化大肠杆菌感受态,成功重组的质粒进行测序,对其结果进行整理分析和比对后发现,得到了PVS的复制酶(RNA-directedRNApolymerase,RdRp)基因的部分序列。
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