为探讨解偶联蛋白3(uncoupling protein 3,UCP3)基因在不同生长发育时期、不同组织之间的启动子甲基化水平差异以及DNA甲基化对mRNA表达水平的影响,本研究利用重亚硫酸氢盐测序(Bisulfite Genomic Sequencing PCR,BSP)技术检测了 UCP3 基因启动子在1、90和210日龄莆田黑猪的心、胸肌、腿肌、脂肪、背最长肌和耳组织的甲基化水平,并应用荧光定量PCR技术检测UCP3基因在1、90和210日龄莆田黑猪心、胸肌、腿肌、脂肪、背最长肌和耳组织中mRNA的相对表达量;另外为更深入地了解亲本与杂种间DNA甲基化差异与杂种优势的产生之间的关系,本研究利用BSP技术分析UCP3基因启动子在90日龄莆田黑猪、杜洛克猪及其杂交后代杜莆猪的腿肌组织中的甲基化情况,并用荧光定量PCR技术检测UCP3基因在3个品种猪腿肌中的mRNA表达水平,以期为探讨DNA甲基化对UCP3基因表达的可能调控机制以及亲本与杂种间DNA甲基化水平与mRNA表达水平差异对杂种优势产生的可能的表观遗传调控机制的研究提供基础性数据。主要研究过程和实验结果如下:(1)以UCP3启动子区原始序列为参考,运用生物软件BIQ-Analyzer对经过BSP技术处理得到的不同日龄、不同组织的UCP3启动子序列进行分析,结果发现:测序得到的目的片段中共有9个CpG位点,分别位于原始序列的173bp、186bp、201bp、208bp、227bp、234bp、241bp、247bp 和 250bp 处。运用 DNAssist 软件将目的片段与GenBank中的原始序列进行比对,结果表明:除在32bp处和62bp处分别检测到“A→T”与“G→A”的碱基突变外,经重亚硫酸盐修饰后在所有非CpG位点序列中的非甲基化胞嘧啶均转变成胸腺嘧啶,而CpG位点内的甲基化胞嘧啶均保持不变。(2)采用BSP法分析UCP3基因启动子序列中各CpG位点的甲基化状态,结果发现:在CpG位点1处检测到100%的甲基化水平,而在CpG位点5和6处均未检测到甲基化,其余位点的甲基化水平较低且呈现动态变化。(3)采用BSP法分析UCP3基因启动子区在相同日龄莆田黑猪心、胸肌、腿肌、脂肪、背最长肌和耳组织的甲基化状态,结果表明:在3个日龄的各组织中,腿肌的甲基化水平均为最低、心次之、耳组织的甲基化水平均为最高,但不同组织之间甲基化水平差异并不显著(P>0.05)。(4)采用BSP法分析UCP3基因启动子区在1、90、210日龄莆田黑猪相同组织中的甲基化状态,结果表明:UCP3基因启动子区的甲基化水平在90日龄最低,在210日龄时最高,但不同日龄之间甲基化水平差异不显著(P>0.05)。(5)采用BSP法分析90日龄莆田黑猪、杜洛克、杜莆猪的腿肌组织中UCP3基因启动子的甲基化水平,结果表明,莆田黑猪、杜莆猪和杜洛克猪腿肌组织UCP3基因启动子的甲基化水平分别为14.81%、11.11%、18.52%,在3个猪种UCP3基因启动子的甲基化水平中:杜莆猪最低,莆田黑猪次之,杜洛克猪最高,但各猪种间甲基化水平差异并不显著(P>0.05)。(6)本研究中杜莆猪的甲基化水平与其母本莆田黑猪较为接近,总体上与其亲本差异不显著(P>0.05),但杜莆猪的各CpG位点的甲基化模式和水平与其亲本相比,其CpG位点8和9发生了去甲基化,荧光定量的结果表明杜莆猪UCP3表达量的显著高于亲本(P<0.05),可以看出在特定位点的甲基化水平变化对杂种优势具备显著效应。(7)应用荧光定量PCR技术检测1、90和210日龄莆田黑猪UCP3基因在心、胸肌、腿肌、脂肪、背最长肌和耳组织中的mRNA相对表达量,结果表明:90日龄心脏组织中的mRNA的表达量要显著高于210日龄(P<0.05);90日龄腿肌、背最长肌和耳组织中的mRNA表达量显著高于1日龄和210日龄(P<0.05);胸肌和脂肪中的mRNA表达量在3个日龄阶段之间差异不显著(P>0.05)。对于1日龄和210日龄莆田黑猪来说,心和腿肌组织中中的mRNA表达量要显著高于胸肌、脂肪和背最长肌(P<0.05),胸肌、脂肪和背最长肌中的mRNA表达量显著高于耳组织(P<0.05);在90日龄莆田黑猪中,腿肌中的mRNA表达量显著高于心(P<0.05),心的mRNA表达量显著高于胸肌、脂肪和背最长肌(P<0.05),胸肌、脂肪和背最长肌中的mRNA表达量显著高于耳组织(P<0.05)。(8)应用荧光定量PCR检测UCP3基因在90日龄莆田黑猪、杜莆猪和杜洛克猪腿肌组织中mRNA的相对表达量,结果表明:莆田黑猪、杜莆猪和杜洛克猪腿肌组织中mRNA的相对表达量分别为1.16±0.03、1.3±0.03和1.1±0.04,UCP3基因在杜莆猪腿肌组织中的mRNA相对表达量显著高于莆田黑猪和杜洛克猪(P<0.05)。