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MHCⅠ类分子由两条多肽链组成,一条为轻链,即β2微球蛋白;另一条为重链,其胞外段由α1、α2及α3区组成,其中α1、α2区共同构成抗原肽结合槽,用于结合特定的抗原肽,形成pMHC,供T细胞表面的TCR识别。H-2复合体为小鼠的MHC,其中H-2K基因座与H-2D、H-2L基因座同属小鼠MHCⅠ类分子复合体。MHCⅠ类分子在抗原提呈和T细胞活化中发挥了重要的作用。可溶性MHC-Ig二聚体技术是近几年发展起来的一种免疫学新技术,主要用于检测抗原特异性T细胞。这种二聚体蛋白具有两个供TCR识别的MHC分子,它们是通过Ig铰链区二硫键的作用而形成。相对于单体分子而言,可溶性MHC-Ig二聚体分子在与TCR的结合中具有更强的稳定性。该二聚体分子MHC段的抗原结合槽可加载MHC限制性的抗原肽,形成抗原肽-MHC(pMHC)二聚体复合物,它可以用来检测抗原特异性T细胞。此外,有文献报道, pMHC二聚体复合物可以结合在微球等非细胞载体上用于活化抗原特异性T细胞。在本课题中,我们成功的构建和表达了可溶性H-2K~d/IgG2aFc二聚体融合蛋白,该二聚体由小鼠H-2K~d的胞外段和IgG2a的Fc段组成。体外实验证实,与可溶性H-2K~d/IgG2aFc二聚体共同孵育后的C57BL/6小鼠(H-2Kb)腹腔巨噬细胞能够被抗H-2K~d的特异性抗体标记。实验结果提示我们,可以利用该二聚体Fc段与Fc受体的作用将H-2K~d分子结合到小鼠的巨噬细胞表面,这一研究成果为进一步探讨T细胞识别巨噬细胞表面抗原肽的机制提供了新的方法,该方法可应用于活化抗原特异性的CTL。与以前的方法相比,该方法与体内CTL天然的活化过程更为相似,具有更大的应用前景。一.H-2K~d/IgG2aFc真核表达载体的构建方法:利用本室前期构建完成的pBS-T-H-2K~d(extra)和pGEM-T-IgG2aFc为模板,通过重组PCR技术,经两轮反应得到H-2K~d/IgG2aFc融合基因,PCR产物经凝胶回收后,通过限制性内切酶HindⅢ和xbalⅠ双酶切与经过相同的酶切后的载体pcDNA3.1(+)连接,形成H-2K~d/IgG2aFc真核表达载体。结果:通过限制性酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定证实了H-2K~d/IgG2aFc融合基因与预期序列一致,并成功的连接到载体中形成pcDNA3.1(+)-H-2K~d/IgG2aFc真核表达载体。二.可溶性H-2K~d/IgG2a Fc二聚体融合蛋白的表达及功能研究方法:通过电穿孔法将pcDNA3.1(+)-H-2K~d/IgG2aFc真核表达载体转染到J558L细胞中,通过G418筛选,得到稳定表达的克隆株,通过RT-PCR鉴定H-2K~d/IgG2aFc融合基因在阳性克隆株中的表达。大量提取J558L克隆株的上清,通过葡萄球菌蛋白A(SPA)纯化得到可溶性H-2K~d/IgG2aFc二聚体融合蛋白。通过流式细胞术检测可溶性H-2K~d/IgG2aFc二聚体融合蛋白与巨噬细胞表面Fc受体的结合能力。结果:通过细胞RT-PCR,我们得到一段长度为1602bp的序列,说明H-2K~d/IgG2aFc融合基因能够在转染阳性的J558L克隆株中表达。Western-blot和ELISA结果证实了纯化得到的融合蛋白由H-2K~d的胞外段与IgG2a的Fc段两个部分组成,与我们的预期构想一致。流式细胞术结果证实,可溶性H-2K~d/IgG2aFc二聚体融合蛋白能够与小鼠巨噬细胞表面的Fc受体结合。综上所述:本课题将可溶性H-2K~d/IgG2aFc二聚体通过Fc与Fc受体的作用结合到鼠的巨噬细胞上,这提示我们,结合了二聚体的APC细胞加载抗原肽后可用于活化抗原特异性的T细胞,应用于肿瘤和病毒感染性疾病的过继免疫治疗中。