【摘 要】
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VDAC（Voltage-dependent anion channel）是线粒体外膜上的主要离子通道,参与细胞质和线粒体膜间物质、能量交换,在细胞程序性死亡、物质运输、能量代谢以及信号转导过程中起着重要的作用。实验室前期从水稻基因组中鉴定出8个OsVDAC基因,本实验从转基因植株生理功能鉴定、亚细胞定位以及互作蛋白筛选鉴定等方面分析OsVDAC6的功能及调控机理,取得以下结果:1.检测Nip、Y
【基金项目】
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国家自然基金项目（31170226）；
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VDAC（Voltage-dependent anion channel）是线粒体外膜上的主要离子通道,参与细胞质和线粒体膜间物质、能量交换,在细胞程序性死亡、物质运输、能量代谢以及信号转导过程中起着重要的作用。实验室前期从水稻基因组中鉴定出8个OsVDAC基因,本实验从转基因植株生理功能鉴定、亚细胞定位以及互作蛋白筛选鉴定等方面分析OsVDAC6的功能及调控机理,取得以下结果:1.检测Nip、YTB和YTA三个水稻品种不同组织中OsVDAC6的表达量,分析表达模式。在Nip和YTB中,OsVDAC6表达模式相似度高,叶中表达量较高,整个幼穗发育期间维持较低水平。YTA中幼穗发育早期表达量较高,随着穗的发育表达量降低,且后期维持较低的表达。推测OsVDAC6可能与育性有关,但还需进一步证实。2.以YTB为受体材料,通过CRISPR创制OsVDAC6缺失突变体（osvdac6）植株;以Nip为受体材料创制OsVDAC6-超表达（OsVDAC6-OE）植株。经过阳性鉴定、基因型鉴定和表达量检测,得到T2代osvdac6纯合植株31株、杂合24株,表达量上调的OsVDAC6-OE植株6株。3.T2代osvdac6和OsVDAC6-OE籽粒大小及平均单粒重与阴性对照相比,籽粒大小显著减小,平均单粒重降低,推测OsVDAC6参与调控籽粒发育。4.苗期逆境胁迫实验结果表明盐胁迫下T2代osvdac6植株生长受抑制程度大于YTB,说明OsVDAC6可能调控水稻耐盐;渗透胁迫中osvdac6植株生长受抑制程度较低,推测OsVDAC6可能负调控水稻耐旱。同时检测了胁迫前后OsVDAC1-8基因的表达量,发现OsVDAC4与OsVDAC7表达量变化趋势与其他基因差异较大,推测OsVDAC4与OsVDAC7在OsVDAC6发挥功能过程中起重要作用。5.将OsVDAC6CDS克隆至原核表达载体p ET-32a（+）后,在体外15℃的条件下0.5 mmo L/L IPTG诱导8 h得到49 k Da可溶性融合蛋白。改造p M999-GFP瞬时表达载体并成功构建p M999-OsVDAC6-GFP表达载体,通过荧光观察确定OsVDAC6定位于线粒体,为后续互作蛋白的筛选及功能的研究奠定基础。6.成功构建了pBT3-SUC-OsVDAC6诱饵蛋白载体,在水稻YTB c DNA膜蛋白酵母双杂交文库中筛选到2个可能的互作蛋白。通过酵母杂交点对点验证,确定OsVDAC6通过N端与OsV6IP1/OsV6IP2互作。将OsVDAC6-N端氨基酸按照亲/疏水性进行突变,进行点对点验证,结果证明OsVDAC6与OsV6IP1互作的位点为第2位K以及第7位F（除去第一位Met）,OsVDAC6与OsV6IP2互作的位点为第2位K,第3位G与第5位A。7.将OsV6IP1/OsV6IP2克隆至原核表达载体p GEX6p-1中,体外诱导表达可溶性蛋白GST-OsV6IP1/OsV6IP2,pull down结果显示OsVDAC6与OsV6IP1发生了互作,OsVDAC6与OsV6IP2在体外未检测到互作。8.分析OsV6IP1/OsV6IP2的定位,确定OsV6IP1定位于细胞质,OsV6IP2定位于线粒体。OsV6IP1定位于细胞质,与OsVDAC6-N端在空间上可能存在接触,具有互作的可能性,OsV6IP2与OsVDAC6共定位,为互作提供了依据。9.通过烟草表皮细胞的Bi FC验证了OsVDAC6与OsV6IP1/OsV6IP2存在互作。
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