研究背景:近年,由于自然环境遭到破坏,臭氧层也遭到了不同程度的破坏,有些地方已经出现了臭氧层空洞,破坏的臭氧层过滤作用减弱,因而到达地球表面的紫外线(UV)增多。紫外线可促进机体对维生素D的吸收,但是过度的UV辐射会影响人类健康,一是紫外线辐射会导致皮肤发生光老化,进而使皮质层的胶原纤维产生大量减少,皮肤弹力会有明显的下降,更严重的会发生皮肤结缔组织严重损伤,进而引起皮肤的松弛、下垂和皱纹加深等不良后果;二是短时暴露在高剂量的紫外线环境中,会使皮肤干细胞发生凋亡坏死的现象,这将损害表皮天然屏障的防护功能,进而会引起临床特征性改变包括纹理加深,斑点状色素沉着,皱纹增多,干燥粗糙,皮肤松弛,毛细血管扩张,弹性降低以及良、恶性肿瘤等。皮肤是人体最大的器官,有防止紫外线辐射、调节体温、防止水分丢失、维持外貌以及抵御微生物入侵等作用。皮肤是由非同源性的细胞组成有很强的自我愈合能力。在紫外线的两种不同波段中,UVA会使细胞自由基生成、会使脂质过氧化的能力达到最强,进而会影响真皮组织中胶原以及弹力纤维,从而会产生皮肤的光老化;UVB主要通过引起表皮层和真皮浅层的病变,进而产生日晒的红斑、免疫的抑制及严重者皮肤癌。UVA和UVB相互联合能够在表皮和真皮中导致一系列的病变,并且UVA具有增强UVB红斑作用的能力。UVA可以依靠氧化作用产生过氧化物,后者会引起继发性DNA损伤,从而使UVB的致癌作用得到增强。正常皮肤的自我修复和更新是由不同类型的干细胞共同作用的结果,这是维持皮肤正常的组织结构以及稳定细胞内环境的要求。皮肤分为真皮和表皮,表皮由里及外是由基底层、棘细胞层、颗粒层、透明层和角质层组成,而基底层中含有大量的干细胞,是一细胞集群落,在体内会增殖发育成表皮细胞,表皮干细胞有一个较为缓慢的分裂增殖周期,可引起自细胞的短暂扩增,经过几次分裂后,完成终末分化。体外的研究证明S14G-Humanin在低浓度下即可显著抑制干细胞损害,对干细胞、原代皮层细胞死亡都有显著性的抑制作用。S14G-Humanin既可以通过抗细胞死亡途径来发挥其干细胞保护作用,还可以通过与特定受体结合而起到细胞保护作用,其中包括促细胞凋亡Bcl-2家族蛋白Bim、Bid和Bax。皮肤长期暴露于UV照射可引起细胞DNA的损伤和突变,一旦受到损伤,机体会启动修复程序,细胞内的一些基因被抑制,一些基因被激活。若是不能修复损伤的DNA则会启动细胞凋亡程序。细胞凋亡与凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡加速基因Bax密切相关。Bcl-2蛋白能够抑制细胞凋亡,与Bax结合形成异源二聚体后,通过抑制细胞色素C的释放,进而抑制下游的caspase-3的激活,从而实现抑制细胞凋亡的目的。另外Bax蛋白还有促进细胞凋亡的作用,可直接在线粒体膜上建立跨膜通道,促进细胞色素C的释放,通过调控细胞色素C达到促进细胞凋亡的目的。Bcl-2和Bax的比例决定了细胞是否凋亡,两者间形成对细胞凋亡的正向调控。JAK2/STAT3信号通路是近年来研究最为广泛的信号转导通路之一。STAT3信号通路的作用是通过将细胞膜检测到的信号直接传递给细胞核,进而使靶基因转录被激活。研究发现,细胞因子(CNTF,IL2,IL6等)和生长因子(PDGF,EGF,CSF等)都是通过这种信号转导途径来诱导细胞的分化,增殖或凋亡的发生,并在细胞中发挥特异性和多功能的生物学功能,进而起到调节免疫功能,肿瘤发生和造血的作用。PI3K是磷酸化磷脂酰肌醇磷脂酰激酶家族的一员,在肌醇环D3的位置上。PI3K家族主要结构涉及细胞外信号转导,进而反应产物是第二信使,其目标是丝氨酸/苏氨酸激酶。Akt位于PI3K的下游,并受到细胞外刺激的激活,Akt经细胞质转移到细胞膜,同时在细胞质Akt的两个残基(苏氨酸308和丝氨酸473)磷酸化,进而引起Akt的完全激活。Akt通路的作用是可以抑制细胞凋亡并促进细胞生长。PI3K/Akt和JAK2/STAT3是非常重要的信号通路。它们参与许多病理生理过程,例如细胞活化,凋亡,炎症反应和趋化性的产生。这两个信号通路参与了各种针对细胞凋亡的干预机制,但是是否参与了表皮细胞氧化应激,自由基代谢和DNA损伤尚待研究。1.S14G-humanin(HNG)对紫外线-B诱导的表皮干细胞损伤的保护作用目的:探究S14G-humanin(HNG)对紫外线-B诱导的表皮干细胞损伤的保护作用。方法:分离了小鼠表皮干细胞,并在紫外线(UV)-B处理下研究了HNG对表皮干细胞的细胞保护作用。实验细胞随机分为4组:空白对照组、紫外线组、100μM HNG预处理组和200μM HNG预处理组,每组包括60个培养皿。干预措施:将ESC用100μM和200μM HNG处理12小时,用50m J/cm2的紫外线刺激12小时。MTT细胞存活和LDH细胞毒性实验。使用MTT测定法测试细胞活力;实时PCR分析Wtn3a、Myc和细胞周期蛋白D1的转录水平;蛋白质分离和蛋白质印迹分析Wtn3a、Myc和细胞周期蛋白D1的表达;活性氧(ROS)的测量;TMRM染色;还原型谷胱甘肽(GSH)的测定。结果:HNG抑制UV-B诱导的ROS产生并增加抗氧化剂谷胱甘肽的表达。HNG预处理的细胞在暴露于UV-B后有细胞因子产生,包括TNF-α,IL-1β和IL-6。HNG预处理对UV-B介导的细胞毒性有保护作用并促进ESC存活。此外,HNG治疗减弱了UV-B诱导的线粒体膜电位(MMP)的减少,并保持其干细胞能力。机制上,HNG处理改善了UV-B诱导的Wnt/β-连环蛋白的减少,包括Wtn3a、Myc和细胞周期蛋白D1。结论:HNG在表皮干细胞中起着促生存和抗氧化应激的作用,并有可能用于ESC介导的治疗。2.S14G-humanin(HNG)缓解紫外线诱导的小鼠皮肤干细胞自由基代谢和DNA损伤的分子机制目的:探索S14G-humanin(HNG)缓解紫外线诱导的小鼠皮肤干细胞自由基代谢和DNA损伤的分子机制。方法:实验细胞分为两组:S14G-humanin质粒转染组、空白对照组,每组包括60个培养皿。干预措施:S14G-humanin质粒转染组和空白对照组的细胞用30J/m2的紫外线刺激12小时。对小鼠皮肤干细胞进行转染,利用RT-PCR对S14G-humanin靶基因表达进行分析,对转染后的细胞的凋亡状态利用流式细胞仪进行分析,通过Western blot对凋亡蛋白及细胞通路蛋白表达量进行测定。结果:功能性S14G-humanin V143A选择性增强了参与细胞生长阻滞和DNA损伤修复的S14G-humanin V143A靶点的表达,而非凋亡;紫外照射后S14G-humanin组的细胞凋亡或细胞周期分布未受到紫外线的显著性影响(P>0.05);Western blot实验结果表明,S14G-humanin V143A组p-c-Jun的表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),S14G-humanin V143A的表达抑制了紫外线刺激的JNK活性,抑制了JNK信号的传递。结论:S14G-humanin(HNG)通过抑制JNK信号通路缓解紫外线诱导的小鼠皮肤干细胞自由基代谢和DNA损伤。3.S14G-humanin(HNG)缓解氧葡萄糖剥夺复氧对表皮干细胞损伤机制的研究目的:研究S14G-humanin(HNG)缓解氧葡萄糖剥夺复氧对表皮干细胞损伤的机制。方法:从小鼠背部皮肤中分离出表皮干细胞ESC进行细胞培养,并随机分为3组:对照组(正常细胞培养板中培养16个小时的细胞);诱导组(密封室中剥夺葡萄糖和血清,在37℃下产生缺氧条件下培养,随后在正常培养基中构建氧葡萄糖剥夺/再氧合模型)和HNG+诱导组:在诱导组基础上加入1μg/l的HNG继续培养5个小时;HNG+诱导组+抑制剂组(分别添加FLLL32、LY294002和MK-2206等特异性抑制剂来研究PI3K/AKT通路与Jak2/Stat3的激活情况);通过TMRM染色测量线粒体跨膜电位的水平;使用DCFH-DA测定活性氧;通过q RT-RCR和蛋白质免疫印迹检测细胞凋亡和相关因子蛋白的表达;用CCK8检测细胞活力,使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。结果:在氧葡萄糖剥夺/复氧的条件下,HNG提高了ESC活力,降低凋亡率,并降低了细胞内ROS水平,促进GSH生成,阻止线粒体跨膜电位降低;HNG提高了Jak2、Stat3、p-Jak2和P-Stat3蛋白的表达水平,降低了促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)m RNA的表达和凋亡蛋白Bax、caspase的表达。机制上,Jak2/Stat3通路被抑制后,凋亡蛋白Bax、caspase的表达水平升高和凋亡率升高;PI3K/AKT通路被抑制后,Jak2和Stat3蛋白表达明显降低。结论:S14G-humanin(HNG)通过PI3K/AKT通路激活Jak2/Stat3的表达从而缓解氧葡萄糖剥夺复氧对表皮干细胞的损伤。4.S14G-humanin通过增强抗氧化防御系统和激活pparα保护表皮细胞免受氧化应激损伤的机制目的:研究S14G-humanin通过增强抗氧化防御系统和激活pparα保护表皮细胞免受氧化应激损伤的作用机制。方法:通过传代、冻存、复苏等进行细胞培养,使用H2O2建立表皮细胞氧化应激损伤模型,将实验分为空白对照组,H2O2损伤模型组,S14G-humanin作用组进行实验。在研究过程中检测细胞增殖活性、观察细胞的形态学特征,使用试剂盒测定细胞中SOD、CAT、GSH、GPx、GST等的活性;提取细胞RNA进行反转录后使用PCR扩增仪进行扩增,琼脂糖电泳,进行凝胶成像检测PPAR-αm RNA的表达,并提取细胞蛋白,利用Western blot检测PPAR-α蛋白表达,统计各项试验结果,进行相关性分析。结果:在H2O2作用下,S14G-humanin作用组细胞形态改善,增殖活性提高,抗氧化酶(SOD、CAT、GSH、GPx和GST)活性增强;人ESC内ppar-αm RNA的水平和蛋白表达量升高。结论:H2O2可刺激人表皮干细胞,抑制其生长,S14G-humanin对人表皮干细胞的氧化应激损伤有一定的改善作用。S14G-humanin可使细胞的SOD活性、CAT活性、GSH活性等抗氧化活性系统酶类活性增强,它们是生物体内抗氧化防御系统的主要成分,其活性升高有利于防止机体免受应激伤害。同时S14G-humanin可提高ppar-αm RNA水平、促进PPAR-α蛋白的表达,从而保护表皮细胞免受氧化应激的损伤