骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是常见的骨的恶性肿瘤，好发于青少年，其发病率占恶性骨肿瘤总数的20%，占儿童肿瘤总数的5%。骨肉瘤恶性程度高，早期即可发生广泛的肺转移，约20%的骨肉瘤患者发生可被影像学方法检测的肺转移，而80%的骨肉瘤患者在单纯手术切除后发生转移。肺转移引起的呼吸衰竭是导致骨肉瘤死亡的常见原因。研究发现许多致病因素如化学因素、放射性物质、病毒感染等均能诱导骨肉瘤的发生。同时在骨肉瘤的发生发展过程中，伴随着一系列的基因和表观遗传学的改变，但这一系列的改变不具有一致性。因而目前的观点认为，骨肉瘤的发生是一个多阶段演进和多基因参与的过程，但确切的发病机制尚未阐明。随着肿瘤病因学研究的深入，发现肿瘤不仅是一种遗传有关的疾病，同时也是一种表遗传性疾病，几乎所有的肿瘤中都有表观遗传的异常。其中印迹基因作为一种表遗传学机制，以原癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生及演进，备受关注。近年来，随着干细胞研究的不断深入以及肿瘤干细胞理论的提出，越来越多的证据显示肿瘤是由其内部的一小部分细胞所始动和维持的，这一小部分细胞被称作肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）。和普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞不仅具有自我更新和多向分化潜能，同时还具有诱导肿瘤形成的能力。自1994年Lapidot在白血病细胞中通过特异性细胞表面标志分离出具有自我更新和维持其恶性能力的急性粒细胞性白血病干细胞以来，研究者们陆续从脑肿瘤、乳腺癌、消化道肿瘤、恶性黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等分离得到了肿瘤干细胞。在间叶性肿瘤中，Gibbs等报道在骨肉瘤中存在一小部分具有自我更新能力，并能在无血清悬浮培养条件下形成肿瘤细胞球的细胞，这部分细胞高表达STAT3和多潜能干细胞标记Oct3/4、Nanog，从而显示出干细胞样的特性。该研究将肿瘤干细胞学说扩展到了间叶来源的肿瘤，证实了肉瘤中肿瘤干细胞的存在。随后陆续有多个实验室以不同的方法证实了骨肉瘤肿瘤干细胞的存在。骨肉瘤干细胞为治愈骨肉瘤提供了可能，但也带来了一系列难题，由于骨肉瘤干细胞的放化疗抵抗和高转移特性，使得目前的治疗手段都不能根治肿瘤。寻找可行的治疗手段是目前面临的关键问题。我们课题组在前期研究中发现印迹基因TSSC3(tumor-suppressing STF cDNA3)与骨肉瘤的发生发展及抗失巢凋亡能力有关。TSSC3基因，又名IPL基因(imprinted inplacenta and liver),定位于染色体11p15的胚胎肿瘤抑制区，属PHLDA基因超家族，呈母系等位基因表达，与TDAG51(T cell death associated gene51)高度同源，并含有与凋亡相关的PQ蛋白基序，推测TSSC3印迹基因在细胞凋亡中发挥作用。我们前期研究发现骨肉瘤细胞系SaOS2中TSSC3基因启动子区CG位点的平均甲基化率高，用去甲基化药物处理该细胞后TSSC3表达明显增高，且细胞凋亡率也显著增加。利用载体稳定高表达TSSC3，发现高表达TSSC3在体外能抑制骨肉瘤细胞增殖，在体内能抑制肿瘤生长，并通过线粒体途径诱导骨肉瘤细胞凋亡和增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。但TSSC3在作为肿瘤起始细胞的肿瘤干细胞中的作用尚待研究。为了研究TSSC3在骨肉瘤干细胞中的作用及可能的分子机制，我们拟首先利用不同方法从MG63、SaOS2和恶性转化的人成骨细胞hFOB1.19(MThFOB1.19)中分离鉴定出肿瘤干细胞，并检测印迹基因TSSC3在干细胞中的表达，然后利用不同载体上调或下调骨肉瘤细胞中TSSC3的表达，最后检测差异表达TSSC3对骨肉瘤干细胞干性和凋亡的影响及其作用机制。有鉴于此，本研究分三部分进行：第一部分拟通过肿瘤干细胞成球培养和基于骨肉瘤干细胞表面标记(CD133、CD117、Stro-1)的流式细胞仪分选方法从MG63、SaOS2和恶性转化的人成骨细胞hFOB1.19(MThFOB1.19)中分离鉴定骨肉瘤干细胞。并根据MThFOB1.19细胞的高克隆形成特性，利用连续克隆形成和成瘤实验从该细胞中分离出肿瘤干细胞，并对其自我更新、多向分化和诱导肿瘤形成的能力进行检测，通过免疫荧光、RT-PCR等技术进一步检测干性相关因子的表达。为后续实验提供细胞模型。第二部分拟采用RT-PCR、western-blot、免疫细胞化学、免疫荧光等实验手段检测不同方法所获得的骨肉瘤干细胞中TSSC3的表达。采用RU486可诱导表达系统稳定上调MThFOB1.19骨肉瘤细胞系中TSSC3的表达，检测高表达TSSC3对骨肉瘤细胞自我更新能力及成瘤能力的影响。以明确TSSC3在肿瘤干细胞干性维持中的作用。第三部分拟采用不同载体稳定上调或下调骨肉瘤细胞中TSSC3的表达，检测凋亡相关印迹基因TSSC3对骨肉瘤干细胞凋亡的调控作用，以及在化疗药物顺铂的作用下，骨肉瘤干细胞凋亡率的变化，并以MThFOB1.19为模型，利用RT-PCR、免疫荧光、western-blot等检测凋亡通路中相关分子的表达变化，以明确TSSC3诱导骨肉瘤干细胞凋亡的可能通路，进而寻找TSSC3诱导骨肉瘤干细胞凋亡的可能机制。主要结果如下：一、成功分离和鉴定出骨肉瘤干细胞1.采用干细胞培养法分离骨肉瘤干细胞，结果显示：①在干细胞培养基中，MG63、SaOS2和MThFOB1.19细胞均能形成肿瘤干细胞球；②MThFOB1.19较MG63和SaOS2细胞具有更高的肿瘤干细胞形成率，分别为：67.09±9.28%，5.40±1.06%和8.60±1.16%；③MThFOB1.19肿瘤干细胞球高表达干性因子Nanog、Oct4和Sox2；说明骨肉瘤干细胞可来源于分化的成骨细胞；2.在MThFOB1.19细胞中：①绝大部分细胞能形成克隆和亚克隆，比例分别为100%和92.7±4.29%，表明该细胞具有很强的自我更新能力；②克隆细胞成瘤能力强，5×104细胞即可诱导肿瘤形成；③具有向脂肪方向分化的能力；④细胞高表达干性因子Nanog、Oct4和Sox2，说明该细胞系中大部分细胞具有肿瘤起始细胞的特点；3.采用干细胞表面标记分选骨肉瘤干细胞，结果显示：在SaOS2细胞中，CD133+、CD117+和Stro-1+细胞比例分别为：0.4%、4.8%和3.3%，说明在该细胞中干性标记阳性的细胞非常少，表明不同细胞系具有不同的肿瘤干细胞比例，与细胞本身特性相关。二、发现印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中低表达，高表达TSSC3降低MThFOB1.19细胞的干性和抑制骨肉瘤生长1.印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中低表达：①在MG63、SaOS2和MThFOB1.19肿瘤干细胞球中，TSSC3在转录水平和翻译水平的表达均较贴壁培养的细胞低；②在SaOS2细胞中，CD133+、CD117+和Stro-1+细胞TSSC3的表达分别较CD133-、CD117-和Stro-1-细胞的表达低，差异具有统计学意义，表明TSSC3基因的低表达可能在维持骨肉瘤肿瘤干细胞特殊功能中起重要作用；2.针对TSSC3，成功构建RU486可诱导表达载体系统。将该系统转染入MThFOB1.19细胞后，在浓度为1μg/ml的米非司酮诱导下，TSSC3的表达在mRNA水平和蛋白水平都明显升高，最终在蛋白水平升高约5倍；3.在MThFOB1.19细胞中，高表达TSSC3降低骨肉瘤干细胞干性和抑制骨肉瘤生长:①高表达TSSC3降低干细胞球形成率，由66.12±9.36%减少到46.82±8.37%；②高表达TSSC3降低细胞的克隆形成率，由95.32±4.58%减少到57.57±2.16%；③高表达TSSC3减少克隆中的细胞数量；④高表达TSSC3在体内抑制骨肉瘤的生长，在第6周的时候，高表达TSSC3克隆来源的肿瘤体积较对照细胞来源的肿瘤体积减少约78.56%；⑤高表达TSSC3降低干性因子Nanog、Oct4和Sox2的表达；Nanog降低最为显著，与对照相比降低了80%，Oct4和Sox2分别降低了20%和40%。三、高表达TSSC3通过线粒体途径增加骨肉瘤干细胞自然凋亡率1.差异表达SaOS2细胞中的TSSC3影响骨肉瘤干细胞比例：①在体外低表达TSSC3增加骨肉瘤干细胞比例，高表达TSSC3降低骨肉瘤干细胞比例；②在体内高表达TSSC3降低骨肉瘤干细胞比例，低表达TSSC3增加骨肉瘤干细胞比例；2.高表达TSSC3通过线粒体途径增加骨肉瘤干细胞的自然凋亡率：①高表达TSSC3增加SaOS2细胞中CD133+、CD117+和Stro-1+细胞的自然凋亡率；②高表达TSSC3增加MThFOB1.19干细胞球中细胞的自然凋亡率；③高表达TSSC3增加MThFOB1.19干细胞球中Caspase3、Bak、Bim、Cytc、Apaf-1、Noxa和Puma的表达，增加Bax：Bcl2的比值，减少Caspase3前体蛋白和Caspase9前体蛋白，Caspase8前体蛋白无明显改变；④高表达TSSC3降低MThFOB1.19干细胞球细胞的线粒体膜电位；3.高表达TSSC3增强化疗药物顺铂对SaOS2细胞中CD133+、CD117+和Stro-1+细胞的凋亡诱导作用。主要的结论如下：1.大部分MThFOB1.19细胞具有肿瘤干细胞特性，表明骨肉瘤干细胞可来源于分化的成骨细胞；在不同骨肉瘤细胞系中，肿瘤干细胞的比例存在差异，与细胞本身特性相关；2.印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中低表达，表明TSSC3基因的低表达可能在维持骨肉瘤肿瘤干细胞特殊功能中起重要作用；高表达TSSC3可降低肿瘤干细胞干性抑制肿瘤生长，提示TSSC3可成为靶向肿瘤干细胞治疗的靶点。3.高表达TSSC3通过线粒体途径增加骨肉瘤干细胞的自然凋亡率，并增加化疗药对骨肉瘤干细胞的杀伤作用，提示可通过激活TSSC3基因的表达而发挥对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用。深入研究TSSC3诱导骨肉瘤干细胞凋亡的机制，可为骨肉瘤的治疗策略提供新的思路；本研究首次报道了骨肉瘤的肿瘤干细胞可来源于分化的成骨细胞，并进一步从印迹基因角度探讨了TSSC3参与骨肉瘤干细胞干性和凋亡调控的可能机制，上述结果表明增加印迹基因TSSC3的表达可降低骨肉瘤肿瘤干细胞的干性和通过线粒体途径诱导骨肉瘤肿瘤干细胞凋亡，为以TSSC3为靶点、寻找更具特异性的靶向骨肉瘤干细胞的治疗策略提供了理论依据。