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研究背景近年来,我国慢性肾衰竭（chronic renal failure,CRF）患者数量逐年增加,尽管以血液净化技术为代表的肾脏替代疗法已能使CRF患者摆脱尿毒症的威胁,但与普通人群相比,CRF患者因心血管事件而导致的死亡率仍居高不下,此过程中主要的独立危险因素是血管钙化（vascular calcification,VC）,因此探讨CRF患者血管钙化的发生机制具有重要意义。CRF导致的血管钙化是一种区别于动脉粥样硬化的血管钙化类型,始于血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）的成骨分化,主要涉及羟磷灰石晶体在血管壁中的沉积,且与肾脏-血管-骨轴具有密切的联系。Wnt/β-catemin途径能够促进成骨细胞的分化和成骨细胞分泌的胞外基质的生物矿化,在这一过程中起着重要作用。然而,单纯控制高磷血症以及使用Wnt途径抑制剂并不能完全预防或者明显降低尿毒症血管钙化的发生率。近年来医学界对于与钙磷代谢变化相关的另一条信号通路BMP/Smad 途径的关注明显增加。BMP（Bone morphogenic protein,BMP）是一种广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白,是转化生长因子（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族中涉及领域最为广泛的一族,它可以上调包括Smad6、Smad7等转录因子在内的66种基因的表达。研究认为,BMP家族中的BMP2在动脉粥样硬化、血管和瓣膜钙化等过程中均具有重要作用,BMP2激活Smads后通过远端启动子和近端启动子启动成骨细胞特异转录因子（Runt-related transcription factor 2,Runx2）的表达进而诱导成骨细胞分化。但BMP2通过哪种smad调节Runx2的表达,该种smad又是通过何种分子导致钙化的发生目前尚无定论。本研究通过构建大鼠与VSMC钙化模型,借助免疫组化、免疫荧光、RT-qPCR以及Western blot等多种实验方法,明确BMP2在CRF钙化中的作用,并进一步探讨BMP2对下游smad家族蛋白的调控机制,此外本课题还进一步探索了 microRNA在此过程中的潜在作用,并寻找可能参与调控钙化过程的miRNA种类。研究目的1.明确BMP2在慢性肾衰竭血管中层钙化中的作用;2.明确smad蛋白家族在慢性肾衰竭血管中层钙化中的作用;3.探索BMP2调控smad家族参与慢性肾衰竭血管中层钙化的机制;4.寻找BMP2-smad通路中参与调控慢性肾衰竭血管中层钙化的microRNA。研究方法体外实验:体外培养VSMC,将细胞按照1×105个/mL的密度接种于六孔板中,待细胞贴壁后更换为含磷浓度5 mM的培养基,,分别干预0、3、5、7、9天,检测不同干预时间下细胞内ALP浓度与细胞钙含量,确定最佳干预时间,用于后续实验;将VSMC分为对照组、高磷组（pi:5mM）、干预组（pi:5mM+BMP-2抑制剂LDN-193189,250nM）,每组按相应条件分别干预确定的最佳干预天数;体内实验:20只Wistar大鼠随机分为对照组（n=5）、CRF组（n=5）以及干预组（n=10）,对照组常规饲喂,CRF组与干预组采用含0.75%腺嘌呤的高钙高磷饲料饲喂4周,构建慢性肾衰竭模型,造模成功后,CRF组采用高钙高磷饲料维持喂养,干预组在CRF组基础上按2.5 mg/kg/d腹腔注射BMP-2抑制剂,对照组以及CRF组同时等量注射生理盐水作为对照,共治疗2周。检测方法:钙化模型构建成功后,分别采用von kossa染色、RT-qPCR、免疫荧光、免疫组化等分析细胞与动物组间钙化差异、Runx2、BMP2、Smad家族基因与蛋白水平表达差异以及microRNA水平差异。研究结果体外实验:高磷通过诱导BMP2表达促进大鼠VSMC钙化机制研究。1.高磷刺激能够上调BMP2表达,促进VSMC转分化为成骨样细胞,促进钙沉积;2.抑制BMP2可以显著抑制VSMC的转分化以及钙沉积;3.BMP2通过上调Runx2以及p-smad1/5/8表达发挥促进钙化作用;4.VSMC钙化时,miR-30b、miR-30c表达明显下调,再抑制BMP2后,二者表达显著升高。体内实验:BMP2促进CRF大鼠血管钙化机制研究。1.CRF大鼠发生显著血管钙化,高表达BMP2、Runx2;2.抑制BMP2可以显著抑制钙化,下调Runx2表达;3.CRF血管钙化时,p-smad1/5/8水平升高,smad6表达下调,抑制BMP2后p-smad1/5/8 下降,smad6水平上升。4.CRF钙化时,miR-30b、miR-30c表达下调,再抑制BMP2后,二者表达上升。研究结论BMP2依赖smad1/5/8的磷酸化促进Runx2的表达进而促进CRF血管钙化,smad6、miR-30b、miR-30b在此过程中发挥负性调节作用,应用BMP-2抑制剂可以显著减轻血管钙化。