虫生真菌因在防治农林害虫时具有对环境无污染、无残留和使害虫不易产生抗药性等优点,是一种环境友好型真菌。随着人们对环保意识的增强,利用虫生真菌防治农林害虫受到人们的广泛关注及重视。莱氏野村菌在田间能够自然侵染多种夜蛾科害虫并引起域内流行病,是一种重要的昆虫病原真菌。莱氏野村菌作为杀虫剂的有效成分是分生孢子,但是由于其产孢条件比较苛刻如需要苛刻的碳源(麦芽糖)和持续光照,其工业化生产方面一直受到极大限制,所以寻找该菌的其他繁殖体来代替分生孢子行使杀虫作用具有十分重要的意义。液体发酵产生的芽生孢子虽然有一定侵染力,但因其细胞壁比较薄、不耐储存以及毒力低等特点也不能用于生产实践。微菌核是真菌菌丝聚集而形成特异休眠体结构,它具有耐储存、抗逆性强、在适宜的环境下能萌发产生菌丝和孢子。重庆大学生命科学学院微生物实验室成功的诱导出莱氏野村菌的微菌核,并对其的抗逆性和毒力等进行了测试,实验结果证实该微菌核可以作为有效的活性成分来代替分生孢子用于害虫的生物防治制剂。其后,采用比较转录组技术从分子层面来探讨微菌核形成机理,发现在微菌核形成与氧胁迫密切相关,并且在微菌核形成的过程中大量的还原性酶或合成还原性物质的基因上调表达。依据此,本课题从比较转录组上调表达的c DNA文库中挑取Nraox基因的EST序列,将其克隆并采用RNA干扰技术来研究该基因在微菌核发育过程中的作用。主要研究结果如下:①莱氏野村菌Nraox基因的克隆与序列分析根据莱氏野村菌转录组库中Nraox基因的EST序列,克隆得到该基因的c DNA全长序列(Gen Bank登录号:No.KM978957)。序列分析显示其开放阅读框为1068bp,编码355个氨基酸;生物信息学分析表明该蛋白的理论分子量为40.517KD,理论等电点为9.53;该蛋白具有亲水性,无信号肽,亚细胞定位分析该蛋白定位于线粒体内。Nraox的基因组全长为1512 bp,该基因含有3外显子,2内含子。利用DNAMAN和MEGA软件进行同源比对和系统进化分析发现,莱氏野村菌的AOX蛋白与绿僵菌的同源性最高,并与麦角菌科的真菌聚为一组,同源性都达到88.17%。②莱氏野村菌Nraox的表达分析收集莱氏野村菌微菌核发育不同时期的样品,采用荧光定量q PCR的方法对Nraox基因的表达模式进行分析,结果表明该基因在微菌核发育的不同时期均有表达,并在微菌核形成初期表达量最高,然后降低;采用q PCR技术检测Nraox在氧胁迫诱导剂处理后的基因表达,研究结果表明,氧化剂H2O2和甲萘醌都能引起该基因的高度上调表达,H2O2处理后Nraox表达量是对照组的7倍,甲萘醌处理后是对照组的20倍。③抑制剂处理对交替氧化酶功能的验证采用交替氧化酶的特殊抑制剂SHAM处理后,检测细胞内过氧化氢含量变化,结果显示,与对照组相比,抑制剂SHAM处理后前10min中内细胞内H2O2较高,处理15min后没有明显变化;但是,显微观察菌丝形态发现与对照组相比,处理组菌丝表现为弯曲和很多芽状结构的不正常生长状态;而诱导培养基中的微菌核表现为微菌核的形成延迟、微菌核颗粒直径较大以及微菌核结构松散、表面比较蓬松。由此可以确定,抑制剂处理后减缓了细胞内过氧化氢的清除速度,并对细胞产生了一定的氧毒害。④RNA干扰技术验证Nraox基因功能利用RT-q PCR技术对不同浓度si RNA的干扰效率进行检测,结果显示800 n M si RNA能够有效下调Nraox基因的表达,并且该基因表达量下调了约76.1%。与对照组相比,干扰菌株在含有胁迫诱导剂的固体SMAY培养基上生长时,菌落生长缓慢,菌落变小,产孢量降低。而在微菌核诱导培养基AM中生长时,Nraox基因干扰后的微菌核表型发生了明显变化,主要表现为:与野生菌相比,微菌核的形成推迟,微菌核颗粒的直径变大,质地较为疏松;微菌核的生物量和产量显著性降低;显微观察发现相对于对照组,干扰后的莱氏野村菌菌丝显示畸形生长,表现为菌丝上生出很多芽状结构;这些结果表明,Nraox参与了莱氏野村菌微菌核的形成调控。⑤干扰菌株对靶标害虫的致病性鉴定采用点滴法测定干扰菌株微菌核对三龄斜纹夜蛾幼虫的侵染和致病能力,结果发现,干扰菌株相对于野生型菌株对斜纹夜蛾幼虫的致死率下降,半致死时间LT50显著增长,较野生菌株LT50增加26.2%。结论:首次克隆得到莱氏野村菌的交替氧化酶基因,并命名为Nraox。研究了该基因在莱氏野村菌菌丝生长、微菌核的形成、产孢、毒力和氧胁迫等方面的作用,结果表明Nraox通过调节细胞内的氧化还原平衡和菌丝生长来影响莱氏野村菌微菌核的形成、影响到莱氏野村菌产孢,并且在微菌核的毒力方面Nraox也起一定的作用。