通过MDBK细胞增殖BVDV,当细胞80%发生病变时,收获病毒细胞培养物,反复冻融三次后,利用PEG浓缩病毒,得到纯度较高的病毒液,将该病毒液免疫家兔,制备了兔抗BVDV的高免血清。分别用硫酸铵法和辛酸-硫酸铵法提取高免血清中的免疫球蛋白IgG,SDS-PAGE电泳结果表明,辛酸-硫酸铵法提取的IgG纯度较高,而且此法操作简便,便于推广利用。 将提取的免疫球蛋白IgG,采用过碘酸钠法制备酶标抗体,建立了从粪便中检测奶牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。试验的最佳工作条件为,抗体的包被量为150μg/ml,酶标抗体的最适工作浓度为1:200稀释;封闭液为1%BSA-PBST;待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃120min;底物显色时间为室温15min。其特异性试验、交叉性试验和重复性试验结果表明,它是一种特异、敏感、快速、操作简便的方法,该方法适合在生产中应用。 应用建立的双抗体夹心ELISA检测方法对河北省8个大中型奶牛场采集的奶牛腹泻粪样298份进行了检测,结果阳性检出率为42.6%,说明本省奶牛群中也存在着严重的BVDV感染。通过本次调查,了解了河北省牛群尤其是规模化奶牛场中的BVD的存在和流行情况,从而为更好的控制BVD在规模化奶牛场中的流行提供可靠依据。 本试验建立了检测牛病毒性腹泻病毒的反转录-聚合酶链式反应技术。根据已发表的BVDV标准毒株NADL、Osloss等毒株的全序列,选择BVDV保守性比较强的5′非编码区域,利用计算机辅助软件DNAstar设计合成了一对特异性引物,分别对BVDV NADL株、OrengonC₂₄V和猪瘟兔化弱毒疫苗株等不同毒株进行了PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测,BVDV NADL株、OrengonC₂₄V都扩增出了长度约为325bp的片段,而对其他毒株进行扩增,结果均为阴性。扩增产物经BspTI酶切鉴定,证明了该诊断方法具有较强的特异性;敏感性试验证明,该方法可以检测到病毒最低浓度达10^-1TCID₅₀。该诊断技术对BVDV检测不仅具有特异、敏感和快速诊断的优点,而且还可以与猪瘟病毒加以区分。 应用DNAstar软件,对12株国内外发表的有代表性的BVDV E2基因的序列进行了差异分析,结果表明ZM-95中国株E2基因组中有一个H（组氨酸）的插入,造成这一小段明显与其他基因不同的氨基酸序列HYKKK;另外,ILLC、Osloss两株毒株都有一个L（亮氨酸）的插入。通过对12株国内外发表的BVDV E2基因氨基酸序列比较发现,中国的长春184株和ZM-95株与国外的BVDV毒株在E2基因抗原区域存在着明显的差异,这些差异在E2基因的N-端较为明显。