芥菜(Brassica juncea Coss.)是一种著名的十字花科芸薹属蔬菜作物。研究芥菜的抽薹开花及其调控机理,对于芥菜栽培生产和品种选育等研究有着重要的指导意义。近年来,在模式植物拟南芥的研究中发现了180多种与开花调控相关的基因,它们被归类于6条开花调控途径,分别为:光周期途径、春化途径、温敏途径、年龄途径、自主途径和赤霉素途径。开花整合子(floral integrator)能够整合不同途径中的开花信号,形成网络通路,最终调控抽薹与开花时间。其中,SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)和AGAMOUS-LIKE24(AGL24)就是两个重要的开花信号整合子。在拟南芥中发现SOC1和AGL24能形成正反馈调节环,彼此正向调控对方的mRNA水平,促进二者共同高水平表达,以调节开花。在芥菜作物中,SOC1和AGL24之间是否也有这种调节机制,它们之间的调控模式如何,目前尚不清楚。为了阐明芥菜SOC1蛋白与AGL24基因相互作用机制,本研究重点检测了SOC1蛋白是否能作为转录因子与AGL24启动子相互作用,并参与启动AGL24的表达。首先,根据已知的芥菜AGL24基因序列,通过染色体步移法克隆得到AGL24启动子序列。其次,构建AGL24启动子截短体与SOC1酵母单杂交重组表达载体,通过酵母单杂检测了相互作用及其作用区域。最后,还获得了SOC1正反义转基因芥菜体系。意在为以后深入研究SOC1蛋白对AGL24基因的表达调控奠定基础。试验结果详述如下:1、芥菜AGL24启动子的克隆与生物信息学分析提取芥菜基因组DNA,根据已知的AGL24基因序列,设计染色体步移法中3个特异性引物,巢式PCR扩增得到AGL24的5’端启动子区域3020bp,经NCBI序列比对发现为芥菜AGL24基因5’端启动子序列。经过生物信息学分析,预测到启动子核心调控元件TATA-box、CAAT-box等共193个调控元件。分析启动子序列上CArG-box基序,发现了16个类似CArG-box的结构。说明其在开花调控中可能受到多个MADS-box类转录因子的调控,这与其整合子的特质名符其实,但与哪些MADS-box类转录因子存在相互作用,需后续试验进一步研究。2、AGL24启动子截短体与SOC1蛋白的酵母单杂交试验为进一步鉴定芥菜SOC1蛋白与AGL24启动子的相互作用,对AGL24启动子上CAr G-box序列进行分析后,将其亚克隆为含有完整CArG-box序列的3个截短体(简称为AGL24A、AGL24B和AGL24C),其长度分别为923bp、902bp和1096bp,并构建相应的酵母诱饵表达载体(pAbAi-AGL24A、pAbAi-AGL24B、pAbAi-AGL24C)。同时,亚克隆SOC1基因,构建含SOC1的酵母蛋白表达载体pGADT7-SOC1。PCR检测、双酶切及测序表明,两种酵母单杂重组载体构建成功。再依据酵母单杂交操作手册,将pAbAi-AGL24A、pAbAi-AGL24B、pAbAi-AGL24C分别线性化后转入Y1H Gold酵母感受态细胞,得到酵母诱饵受体菌株Y1H[pAbAi-AGL24A]、Y1H[pAbAi-AGL24B]、Y1H[pAbAi-AGL24C]。AbA背景浓度抗性筛选试验发现:在SD/-Ura培养基中添加350ng/ml的AbA,能有效抑制上述单转化子菌株的生长。因此,后续试验选用350ng/ml的AbA作为最适背景抑菌浓度。进一步将含SOC1的酵母蛋白表达载体pGADT7-SOC1分别转入Y1H[pAbAi-AGL24A]、Y1H[pAbAi-AGL24B]、Y1H[pAbAi-AGL24C]的酵母感受态细胞中,获得可表达SOC1蛋白及AGL24截短体的共转化酵母菌株Y1H[SOC1+AGL24A]、Y1H[SOC1+AGL24B]和Y1H[SOC1+AGL24C],PCR检测正确后,涂布在含350ng/ml AbA的SD/-Leu缺素培养基(SD/-Leu+AbA350)30℃倒置培养5~7天。并以Y1H[p53-AbAi+pGADT7-53]作阳性对照,以Y1H[pAbAi-AGL24A+pGADT7]作阴性对照。结果发现:Y1H[SOC1+AGL24B]能在缺素培养基上正常生长;而Y1H[SOC1+AGL24A]和Y1H[SOC1+AGL24C]均不能生长。由此酵母单杂交试验结果说明,芥菜AGL24启动子序列中间的截短体AGL24B能与SOC1蛋白发生相互作用。3、芥菜SOC1正反义载体构建及遗传转化根据芥菜SOC1基因序列,设计上下游均含BamH I酶切位点的引物组合,从芥菜cDNA中亚克隆SOC1,并分别正向和反向插入pBI121。通过PCR筛选,获得正义和反义表达载体(分别记为pBI121-SOC1和pBI121-soc1)。以pBI121空载为阴性对照,采用农杆菌介导法将SOC1的正反义表达载体pBI121-SOC1和pBI121-soc1转化芥菜下胚轴,并分化增殖。通过抗性筛选和PCR目的基因筛查后,获得SOC1转基因芥菜植株正义14株和反义8株。