论文部分内容阅读
细辛是一种常用中药。2015版《中国药典》收载的细辛基源植物有3种:北细辛(Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.),汉城细辛(Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai)和华细辛(Asarum sieboldii Miq.)。北细辛具有解热、降止咳、利水消肿、镇静镇痛、平喘祛痰的作用。北细辛中含有马兜铃酸,马兜铃酸是一种菲类衍生物,属于异喹啉生物碱,会在短时间内导致永久性的肾损伤。研究显示,马兜铃酸类衍生物中的硝基是主要的毒性基团。而马兜铃酸中的硝基,则是来源于天冬氨酸的氨基。马兜铃属和细辛属植物中大都含有马兜铃酸,使用含有马兜铃酸含量过高的药物时,会引起毒副作用。目前,对含马兜铃酸中药的减毒方法主要为炮制和配伍。在分子水平上对含马兜铃酸的药用植物的减毒研究未见报道。综上所述,在前期实验基础上,对北细辛转录组差异基因进行分析,挖掘数据,筛选出与马兜铃酸合成途径有关的重要候选基因并进行分离和鉴定。本研究为在分子水平上研究北细辛的减毒提供重要的科学依据。主要结论如下:1、通过基因差异表达分析,与KEGG数据库进行对比,显著富集的途径有19条,涉及到101,01个Unigene。其中参与到异喹啉生物碱合成途径的Unigene有97个。除去注释信息重复的序列,共筛选到9个具有天冬氨酸氨基转移酶注释的Unigene,它们分别是c290059_g1_i1,c211451_g1_i1,c199520_g1_i1,c211451_g1_i2,c215800_g2_i1,c149320_g1_i1,c377160_g1_i1,c191631_g2_i1,c174134_g2_i1。经过进一步筛选,以c211451_g1_i2作为天冬氨酸转氨酶(Ah AST)的候选基因,为进一步研究奠定了基础。2、利用荧光定量PCR技术,选取候选基因c211451_g1_i2进行表达分析,以Actin作为内参基因。结果表明,基因Ah AST在北细辛叶中表达量较高。3、构建Ah AST的原核载体,成功在大肠杆菌BL21菌株中表达了重组蛋白。4、成功构建植物过表达载体,初步判断植物过表达工程菌可能转入了北细辛愈伤组织中。