肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内的恶性肿瘤之一。在中国具有相对较高的发病率和病死率,2015年HCC新发病例和死亡病例数分别为466,100和422,100例。临床上,由于缺乏特异性的生物标志物和明显的临床症状,大多数HCC患者在被确诊时已处于肝癌晚期,超过80%的患者出现预后不良。另外由于肝癌的复发和转移,目前应用于临床的治疗方法都存在一定的局限性,且治疗效果难以尽如人意。因此,研究与HCC发病和发展有关的分子机制从而发现新的治疗靶点,同时研发新的有效的治疗手段迫在眉睫。外泌体是由多种类型细胞分泌,粒径在30～150 nm之间的囊泡样小体。它包含有供体母细胞的多种蛋白质和核酸物质(包括DNA和RNA),通过作为细胞间通讯的介质参与多种生物学过程,如细胞增殖、迁移和凋亡活动等。其内含物与机体的病理及生理状态密切相关。有研究表明,外泌体在疾病,尤其是在癌症的起源和发展中起着重要作用,是癌症恶性进展的重要参与者。因此分析循环外泌体中的内含物、揭示HCC发生发展的分子机制,有助于发现新的治疗靶点、开发疾病的生物标志物。近年来,循环外泌体中的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)越来越受到关注。lncRNA为一种不具备蛋白编码功能的RNA,可以参与细胞迁移,增殖和凋亡过程的调控,在人类疾病中发挥着关键性的作用,尤其是在癌症形成和发展的过程中。近10年来,随着研究的不断深入,许多学者揭示了lncRNA在HCC的发生、发展和转移中的作用,使其被广泛关注并逐渐发展成为一个高度活跃的研究热点。但仅有少数lncRNA的分子功能得到充分的挖掘,绝大部分的lncRNA的功能未得到鉴定和注释。此外,由于外泌体与其供体细胞间的特异性亲和性,及其天然的生物相容性,是治疗性药物递送的理想载体。目前,已有研究者成功运用外泌体作为癌症化疗药物的载体进行肿瘤的靶向治疗。除运载传统化学药物外,外泌体还可作为一些新型药物的载体。铜胺纳米材料(Copper-cysteamine,Cu-Cy NPs)是一种新型的光敏剂,它在紫外光、X射线及微波的激发下可以产生红光,是实现光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)的主要因素之一。PDT由于低毒、低创、易操作及良好的重现性,成为传统手术和化疗理想的替代方式。PDT主要通过由光激活的光敏剂与组织细胞中存在的氧分子发生反应,产生细胞毒性的活性氧继而引发目标细胞的凋亡而达到治疗目的。目前Cu-Cy NPs的PDT应用仍然处于研究的早期阶段,其生物毒性、光动力反应性以及生物递送途径还未得到充分的评估。本研究包括两部分内容:第一部分,利用肝癌外泌体发现lnc85标志物及相关作用机制研究;第二部分,Cu-Cy新型纳米光敏剂的抗肝癌及外泌体传递效应的研究。在第一部分,主要对HCC循环外泌体中lncRNA的表达特征进行描述,探索其参与HCC发生、发展的分子机制,并评估其作为HCC血清生物标志物的潜在价值;第二部分,通过体内试验和体外试验探讨Cu-Cy NPs在HCC的光动力学治疗中应用的可能性,并探索外泌体作为Cu-Cy NPs运送载体的可能。第一部分:利用肝癌外泌体发现lnc85标志物及相关作用机制研究目的:探索循环外泌体中的lncRNA的表达特征,探索lncRNA参与HCC发生发展的分子机制,并评估其作为HCC血清生物标志物的潜在价值。方法:1.外泌体抽提试剂盒提取4例肝细胞癌患者和6例健康对照者血浆中的外泌体,并通过RNA全转录本测序检测两组血浆外泌体中差异表达的lncRNA和mRNA。2.与包含有34种细胞基因转录本信息的开放数据库进行对比,综合描述HCC患者血浆外泌体中lncRNA和mRNA的相对表达特征。3.超高速离心法提取HepG2和Huh7细胞培养上清中的外泌体并采用Nanosight、TEM和Western blot进行验证.。4.选取血浆外泌体中差异表达量显著升高的lncRNA进行细胞和细胞外泌体的qRT-PCR验证,确定候选差异表达lncRNA。5.针对候选lncRNA设计siRNA,通过siRNA转染HL-7702,HepG2和Huh7细胞,采用CCK-8试剂盒、Transwell试验和流式细胞术检测候选lncRNA对细胞增殖、迁移、以及凋亡的影响,选择对肝癌细胞行为学影响明显的RP11-85G21.1(lnc85)做进一步研究。6.通过Ensembl、LNCipedia version和lncLocator数据库查询lnc85的基因组定位、具体序列信息、序列长度、亚细胞定位等基本信息;并通过靶基因预测网站RegRNA预测lnc85的靶向microRNA。7.qRT-PCR检测lnc85抑制前后HL-7702,HepG2和Huh7细胞中lnc85与mir-324-5p的表达量,探索其表达的相关关系;并通过Western blot检测lnc85抑制后Huh7细胞中mir-324-5p下游基因表达的情况。8.qRT-PCR检测112例肝细胞癌患者及52例健康对照者血清中lnc85的表达,探讨lnc85作为HCC血清生物标志物的潜能。结果:1.A有9,440条,其中有8,963条上调,477条下调。2.HCC患者血浆外泌体中lncRNA与mRNA的相对表达特征分析:HCC血浆外泌体中,相对于mRNA,lncRNA具有更高的表达水平(lncRNA vs.mRNA=4.13 vs.2.21,P<0.01),更高的表达特异度(lncRNA vs.mRNA=25.48%vs.18.99%),较低的剪接效率(lncRNA vs.mRNA=0.38 vs.0.53,P<0.01),以及较低的个体变异度(lncRNA vs.mRNA=0.4 vs.0.68,P<0.01)。3.HepG2和Huh7细胞培养上清外泌体的验证:Nanosight结果显示80%以上的颗粒粒径在30～150 nm之间,峰值为59 nm,符合外泌体的粒径范围;TEM结果展现了外泌体典型的双层膜囊泡样结构;Western blot检测到三种已知的外泌体生物标志物(Alix,HSP70和CD9);经三种验证方法确认细胞培养上清的提取物为细胞外泌体。4.qRTCR验证候选差异表达lncRNA:按照Fold Change≥6且P值<0.05的标准从RNA测序结果中筛选出6条表达上调最明显的IncRNA,分别为lnc544、Inc 380、lnc239、lnc959、lncl71和lnc85;qRT-PCR检测结果显示,6条候选差异表达IncRNA中,除lnc380外,其余5条候选差异表达IncRNA均在肝癌细胞及其分泌的外泌体中表达显著升高(P<0.01),与测序结果一致。5.探讨5条候选IncRNA对细胞增殖、凋亡、以及迁移的影响:(1)对细胞增殖活性的影响:lnc85沉默后,HL-7702、HepG2、Huh7三种细胞的增殖活性显著降低,尤其两种肝癌细胞的增殖活性明显下降(HepG2:P<0.01;Huh7:P<0.01);lnc171的沉默使两种肝癌细胞的增殖活性稍降低(HepG2:P=0.023;Huh7:P=0.030);而lnc544、lnc239、lnc959的沉默仅轻微影响一种细胞类型的增殖活动(lnc544 Huh7:P=0.035;lnc239 HL-7702:P=0.017;lnc959 Huh7:P=0.020)。(2)对细胞凋亡的影响:lnc85与lnc544的沉默,促进了Huh7细胞的凋亡(lnc544:P<0.01;lnc85:P=0.014);而lncl71的抑制,使得 HepG2细胞的凋亡增加(P<0.01);lnc239与lnc959的沉默对细胞的凋亡无明显的影响。(3)对细胞侵袭的影响:lnc85的沉默明显抑制了包括正常肝细胞在内的三种细胞的侵袭能力(HL-7702:P=0.013;HepG2:P=0.015;Huh7:P<0.01),而其余4条IncRNA的沉默均对细胞的侵袭能力无明显影响。6.lnc85的基本信息查询及靶向microRNA的预测结果显示:lnc85定位于1号染色体的157232231-157237136位上,其基因前后10 kb内无任何可编码蛋白的序列;lnc85转录本序列长度为399 bp,其成熟体具有2个外显子;lnc85主要定位于细胞质中(score:0.60);其靶向的microRNA为mir-324-5p。7.lnc85与mir-324-5p表达的相关性及机制研究:(1)qRT-PCR结果显示lnc85沉默前,两种肝癌细胞中lnc85的表达量显著高于正常肝细胞,而mir-324-5p在两种肝癌细胞中的表达明显低于正常肝细胞(P<0.01);lnc85沉默后,细胞中lnc85的表达量明显降低,mir-324-5p的表达量显著升高(P<0.01)。(2)qRT-PCR检测lnc85抑制后,mir-324-5p下游基因mRNA的表达水平,结果显示,lnc85的沉默显著抑制了肝癌细胞中cyclinin Dl、cyclinin B1和c-myc蛋白mRNA的表达水平(P<0.01);此外,lnc85的沉默也导致凋亡蛋白bcl-2和侵袭蛋白MMP 2及MMP 9的mRNA水平的下调(P<0.01)。lnc85表达量的降低可影响增殖、凋亡、侵袭相关蛋白的mRNA水平。(3)Western blot进一步验证Huh7细胞中,lnc85抑制后mir-324-5p下游调控细胞周期蛋白的表达水平,结果显示,lnc85的沉默导致细胞中cyclinin D1、cyclinin B1蛋白水平的下调。(4)lnc85调节肝癌细胞的活动的作用模式:在肝癌中,lnc85的表达水平增高,与mir-324-5p的结合解除了mir-324-5p对下游基因的抑制作用,使得相关基因的表达增加,最终导致细胞的增殖、侵袭功能活跃,凋亡受到抑制。8.lnc85作为HCC血清生物标志物的潜能:HCC患者血清中lnc85的表达量明显高于健康对照者(P<0.01);并且lnc85在AFP阴性的HCC患者血清中的表达水平也显著高于健康对照者;ROC曲线分析结果显示,在区分健康对照者与HCC患者时,lnc85的曲线下面积(AUC)为0.861,当截断值(cut off)为1.514时,lnc85诊断HCC的灵敏度和特异度分别为80.9%和74.5%;而在区分健康对照者与AFP阴性患者时,其AUC为0.872,当cut off为1.692时,lnc85诊断的灵敏度和特异度分别为80.5%和76.4%。结论:1.HCC患者血浆外泌体中,相对于mRNA,lncRNA具有更高的表达水平、更高的表达特异性、较低的剪接效率和个体变异度。2.HCC患者血浆循环外泌体中的差异表达lncRNA可能调控细胞的增殖、凋亡或迁移活动。3.1nc85通过抑制mir-324-5p的表达调节其下游基因,从而调控肝癌细胞的增殖。4.lnc85具有作为HCC血清标志物的潜能,可与其他标志物联合提高肝癌诊断的灵敏度。第二部分:Cu-Cy新型纳米光敏剂抗肝癌作用及外泌体传递效应的研究目的:探讨由新型铜胺纳米材料(Cu-Cy NPs)介导的光动力学技术在体内外环境中对肝细胞癌的作用,以及利用肝癌细胞外泌体传递Cu-Cy NPs的效应研究。方法:1.Cu-Cy NPs抗肝癌研究(1)化学合成法(溶液-凝胶法)合成Cu-Cy NPs,并采用紫外光照法、TEM以及荧光光谱仪表征Cu-Cy NPs的物理学特征;(2)RNO脱色实验、MTT实验检测Cu-Cy NPs单线态氧产率(1O2)、Cu-Cy NPs本身对细胞的毒性、单纯紫外光照对细胞的影响;(3)采用普通光学显微镜观察细胞对Cu-Cy NPs的摄取率,以及采用Calcein-AM和EthD-1荧光双染检测对比在不同的摄取率下Cu-Cy NPs对细胞的光动力学效果;(4)MTT实验、细胞克隆形成实验检测Cu-Cy NPs-PDT对肝癌细胞增殖的影响;(5)Hoechst 33342荧光染色、流式细胞术检测Cu-Cy NPs-PDT对肝癌细胞杀伤途径的探索;(6)通过裸鼠成瘤试验观察Cu-Cy NPs-PDT对体内移植瘤生长的抑制作用;2.利用肝细胞外泌体传递Cu-Cy NPs的效应研究(1)可溶性Cu-Cy NPs与HepG2和Huh7细胞共培养,收集细胞上清,通过超高速离心法分离细胞培养上清中的外泌体,并采用Nanosight、TEM和Western blot验证外泌体;(2)通过RNO脱色试验证实肝癌细胞外泌体包裹Cu-Cy NPs进行传递。结果:1.Cu-Cy NPs抗肝癌研究(1)Cu-Cy NPs的表征:1)TEM观察,Cu-Cy NPs是一种高度结晶的球形晶体,其粒径约为100 nm;2)Cu-Cy NPs在紫外光的激发光下产生红色的荧光,而自然光源下呈无色透明的状态;3)荧光光谱仪测定:Cu-Cy NPs在360 nm的波长下具有最大的激发波长,而在600 nm下具有最强的发射波长。(2)Cu-Cy NPs的作用条件:1)RNO脱色试验:Cu-Cy NPs可在紫外光激发下产生lO2,随着光照时间的延长1O2的产量越多;2)MTT试验:Cu-Cy NPs浓度小于等于25 μg/ml时,无光状态下对细胞的活性无明显影响;3)MTT试验:单纯紫外光照射时,细胞生长活性随着紫外照射时间的延长而逐渐降低,在紫外光照时间达6 min时,细胞生长活性显著下降,而在6 min前对细胞生长的影响较小;因此选择Cu-Cy NPs浓度25 μμg/ml、紫外光照激发5 min作为后续试验条件。(3)Cu-Cy NPs在细胞中的摄取率及在不同摄取率下Cu-Cy NPs对细胞的光动力学效果:加入Cu-Cy NPs与细胞共培养,随着培养时间的延长,细胞摄取Cu-Cy NPs的比例增多,但增加的幅度并不明显;荧光显微镜下观察Cu-Cy NPs被细胞摄取不同程度下的光动力学效果,发现Cu-Cy NPs-PDT对细胞具有较强的杀伤功能,但是在不同的摄取率下,Cu-Cy NPs-PDT对细胞的杀伤比例无明显的统计学差异。(4)Cu-Cy NPs-PDT对肝癌细胞增殖的影响:1)MTT试验结果:无紫外光照时,25 μg/ml浓度的Cu-Cy NPs对细胞活性无明显影响,而受到紫外光照激发后,Cu-Cy NPs可导致细胞活性明显降低(P<0.01);2)细胞克隆形成实验:Cu-Cy NPs单独存在的情况下,细胞克隆形成数与对照组无显著差异,而当其受到紫外光照射后,细胞克隆形成数目明显于低对照组(P<0.05)。(5)Cu-Cy NPs-PDT对肝癌细胞杀伤途径的探索:1)Hoechst 33342荧染:Cu-Cy NPs+UV使得HepG2细胞核浓缩变小,边缘化,核膜裂解呈块状或出现凋亡小体等典型的细胞凋亡的核形态;对照组细胞和单纯Cu-Cy NPs组细胞并未或极少看到细胞凋亡;2)流式细胞术:与对照组和五氟尿嘧啶(5-FU)组相比,Cu-Cy NPs+UV组显著诱导细胞的凋亡(P<0.01);3)Western blot:Cu-Cy NPs+UV组cleaved-PARP和cleaved-caspase3蛋白表达量增加,且作用36 h后凋亡蛋白的表达量明显高于作用24 h。(6)Cu-Cy NPs-PDT对体内移植瘤生长的抑制:将HepG2细胞注射至裸鼠皮下,待皮下肿物直径约5 mm时,取肿物固定包埋切片后HE染色进行观察,可见典型的癌细胞形态(核大深染,核边缘化,核形态各异呈结节状或分叶状);将成瘤裸鼠随机分组处理后观察,5-FU组与Cu-Cy NPs+UV组瘤生长趋势明显低于对照组(P<0.01),而UV组、单纯Cu-Cy NPs组与对照组裸鼠皮下荷瘤的生长趋势无统计学差异(P>0.05)。2.利用肝细胞外泌体传递Cu-Cy NPs的效应研究(1)肝癌细胞外泌体分离验证:细胞培养上清外泌体的验证实验,NanoSight粒子成像显示80%以上的粒径分布在30～150 nm之间,最大粒径为148 nm,这与外泌体的粒径范围相符合;TEM清晰可见外泌体典型双层膜状囊泡样结构;Western blot检测到提取物中外泌体的标志性蛋白Alix、HSP70和CD9。(2)Cu-Cy NPs运输载体的探索:与对照相比(RNO),不含有Cu-Cy NPs的外泌体,无论接受紫外光照与否,都未能产生单线态氧;而含有Cu-Cy NPs的外泌体,在紫外光的照射下,可以产生单线态氧,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:l.Cu-Cy NPs可被紫外光激活,从而产生lO2。2.Cu-Cy NPs与紫外光结合可显著降低HepG2细胞的细胞活性,并由Cu-Cy NPs产生的单线态氧通过诱导细胞凋亡从而杀死癌细胞,抑制动物体内肿瘤的生长。3.Cu-Cy NPs可以被包裹于肿瘤细胞分泌的外泌体,外泌体可以作为Cu-Cy NPs在肿瘤组织细胞靶向运输的载体。