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目的在本研究中,我们对miR-515-5p和CXCL6在NSCLC中的表达情况进行检测,分析两者与NSCLC临床病理参数的关系,同时通过体外细胞实验研究miR-515-5p和CXCL6在NSCLC中的潜在作用以及靶向关系。旨在明确miR-515-5p和CXCL6介导NSCLC细胞增殖、凋亡以及化疗耐药性等作用机制,为寻找NSCLC新型诊疗分子靶点奠定理论和实验基础。方法(1)采集50例于2015年9月～2016年9月期间就诊于苏州大学附属第一医院胸外科且行手术切除的NSCLC患者的癌组织和癌旁相应正常组织。采用荧光定量PCR法分别检测各组织中miR-515-5p和CXCL6 mRNA的表达情况,western blot法检测各组织中CXCL6蛋白的表达情况,免疫组化法检测CXCL6在各组织样本中的分布情况。分析miR-515-5p和CXCL6与NSCLC患者临床病理参数的关系,以及miR-515-5p和CXCL6之间的相关性。(2)将10 ng/mL CXCL6作用于A549细胞,采用微阵列芯片分析CXCL6对肺癌A549细胞miRNA表达谱的影响。将10 ng/mL CXCL6作用于肺癌细胞系H524、HCC827、H1650、95C、95D、A549、H1299、H460 和 BEAS2B,作用24 h后收集细胞,提取细胞总RNA,采用荧光定量PCR法检测各组细胞中miR-515-5p的表达。采用生物学软件预测miR-515-5p的靶基因并通过荧光素酶报告系统进行验证。分别将miR-515-5p mimic或miR-515-5p inhibitor转染A549和H1299细胞,收集培养细胞上清液,用ELISA法检测CXCL6蛋白的含量,检测各组细胞中CXCL6 mRNA的表达。分别将control质粒、miR-515-5p mimic、miR-515-5p mimic+CXCL6 转染 A549 和 H1299 细胞,采用 CCK-8 法检测各组细胞的增殖活性,细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力。采用荧光定量PCR分别检测转移性NSCLC和非转移性NSCLC组织中miR-515-5p的表达。分别将 control 质粒、miR-515-5p mimic、miR-515-5pmimic+CXCL6 转染 A549 和 H1299 细胞,随后各组细胞均用 10 mg/L 顺铂(diamminedichloroplatinum,DDP)处理,48 h后检测细胞的凋亡率。分别用miRNA control、miR-515-5p mimic、miR-515-5p mimic+CXCL6、10 mg/LDDP、miR-515-5p mimic+10 mg/L DDP、miR-515-5p mimic+CXCL6+10 mg/L DDP 处理A549和H1299细胞细胞,48 h后检测各组细胞的增殖活性。结果(1)与癌旁正常组织相比,NSCLC组织中miR-515-5p的表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01),CXCL6mRNA和蛋白的表达水平增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。CXCL6蛋白主要在细胞膜或者细胞质中阳性表达,阳性判定标准为细胞浆染色呈黄色或棕褐色颗粒状。与转移性NSCLC组织相比,非转移性NSCLC组织中miR-515-5p的表达水平增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与癌旁正常组织相比,NSCLC组织中CXCL6蛋白免疫组化染色的平均灰度值增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-515-5p和CXCL6的表达与NSCLC患者的年龄、性别、病理类型、是否吸烟无关,而与患者的临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移有关,即随着NSCLC患者的临床分期越高、肿瘤体积越大、发生淋巴结转移,则miR-515-5p的表达水平越低,CXCL6的表达水平越高。miR-515-5p与CXCL6的表达之间存在负相关(r=-0.833,P=0.001)。(2)CXCL6处理的A549细胞中miR-141、miR-200a、miR-1268、miR-99a、miR-93、miR-101、miR-786、miR-510、miR-196c、miR-515-5p的表达水平发生下调,而miR-17、miR-155、miR-337-5p、miR-215、miR-19b、miR-181b的表达水平则发生上调,结果与miRNA阵列结果相一致。对8个NSCLC细胞中miR-515-5p的表达水平进行检测,结果显示A549细胞、H1299细胞和H460细胞中miR-515-5p的表达水平最低。CXCL6被预测为miR-515-5p的一个靶基因,miR-515-5p在CXCL6上所绑定的位置位于其3’UTR区域。在A549细胞和H1299细胞中,与control组相比,miR-515-5p组细胞中CXCL6 mRNA和蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与control组相比,miR-515-5p inhibitor组细胞中CXCL6 mRNA和蛋白的表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.01)。在A549细胞中,与control组相比,miR-515-5p组细胞各时间点的增殖活性均降低;而当将miR-515-5-5p与CXCL6联合转染细胞后,细胞各时间点的增殖活性较miR-515-5-5p转染组均增高;在H1299细胞中,与control组相比,miR-515-5p组细胞各时间点的增殖活性均降低;而当将miR-515-5-5p与CXCL6联合转染细胞后,细胞各时间点的增殖活性则较miR-515-5p组略有上升。在A549细胞中,与control组相比,miR-515-5p组细胞的迁移能力降低,差异有统计学意义(P<0.01);而当将miR-515-5-5p与CXCL6联合转染细胞后,细胞的迁移能力则有所增高,但与control组相比,差异仍具有统计学意义(P<0.05)。在H1299细胞中,与control组相比,miR-515-5p组细胞的迁移能力降低,差异有统计学意义(P<0.01):而当将miR-515-5-5p与CXCL6联合转染细胞后,细胞的迁移能力则有所增高,与control组相比,差异不具有统计学意义(P>0.05)。在A549和H1299细胞中,与control组相比,miR-515-5p组细胞的凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.01);而当将miR-515-5-5p与CXCL6联合转染细胞后,细胞的凋亡率则降低,与miR-515-5-5p组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。在A549和H1299细胞中,DDP处理后细胞的增殖活性降低;进一步转染miR-515-5p mimic后细胞的增殖活性较DDP处理组降低。而当将miR-515-5p mimic和CXCL6共转染细胞后细胞的增殖活性较miR-515-5p mimic转染组增高。DDP处理后细胞的增殖活性降低;进一步转染miR-515-5p mimic后细胞的增殖活性较DDP处理组降低,而当将miR-515-5p mimic和CXCL6共转染细胞后细胞的增殖活性较miR-515-5p mimic转染组上升。结论(1)miR-515-5p在NSCLC组织中的表达水平与对应的癌旁组织相比表达水平下调;CXCL6在NSCLC组织中的表达水平与对应的癌旁组织相比表达水平上调,两者均与NSCLC患者的临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移有关,miR-515-5p和CXCL6之间存在负相关。(2)miR-515-5p在NSCLC恶性化进程中表现出抑癌基因的特性,能够通过抑制CXCL6的表达,进而抑制NSCLC细胞增殖、迁移并诱导细胞凋亡。miR-515-5p表达抑制或CXCL6表达异常上调可能是造成NSCLC顺铂耐药的原因之一。