原发性肝细胞肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，约占原发性肝癌的百分之九十。其发病隐匿、早期诊断困难、易复发、预后差、死亡率高。MircoRNA是一类存在于真核生物中长约22 nt的非编码、具调控功能的单链小分子RNA，参与生命过程中一系列重要的进程，包括个体发育、器官形成、细胞增殖与死亡、神经细胞和干细胞等细胞的分化、造血生成、脂肪等物质代谢、激素分泌、肿瘤形成等生物学过程。近期研究发现，miRNA在不同肝癌细胞株和不同国家或不同地区的肝癌组织中异常表达，表明miRNA可能参与了肝细胞癌变的过程。已证实的miRNA在HCC中的靶基因包括参与蛋白质合成与水解、细胞周期、细胞增殖、分化与凋亡、信号传导与转录、物质代谢等生物生命进程中的多个基因，涉及到肿瘤发生发展的很多方面。因此，对HCC相关的miRNA进行深入研究是非常有必要的。　　 由于原发性肝细胞肝癌已成为危害人类生命健康的主要肿瘤之一，多年来人们一直在探索治疗原发性肝癌的新方法，不断研制新药物。因此，建立体内动物模型研究HCC的发生发展及筛选治疗HCC的药物不仅是十分必要的，而且需要不断探索更好更有效的体内肝癌研究模型。斑马鱼是近年来兴起的体内动物研究模型，自然界中斑马鱼组织器官的癌变与人类极为相似，这为斑马鱼在体内研究人类肿瘤发展提供了很好的基础。由于斑马鱼肿瘤模型相对于大小鼠肿瘤模型拥有很多优点：易于饲养，经济方便，产卵量高；并且胚胎透明，易于观察癌细胞扩散、转移、渗透和血管生成；在药物筛选方面，斑马鱼可以有效的吸收周围水环境中的小分子化合物，使抗癌药物的大规模筛选简便易行。　　 本研究意在探讨miRNA中的一个重要家族，let-7家族成员：hsa-let-7g在肝癌发生发展中的作用。进而研究hsa-let-7g在肝癌中的具体生物学功能，为miRNA在临床诊断、治疗、预后评估及应用于临床的肝癌治疗奠定理论基础。本研究同时建立了斑马鱼肝癌体内研究模型，为在体内研究miRNA及肝癌的发生发展和筛选抗肝癌药物建立新的体内研究模型奠定实验基础。　　 主要研究内容和结果如下：　　 第一章、Hsa-let-7g在肝癌细胞中的表达特征　　 经qPCR方法检测发现，与人正常肝细胞LO2相比，hsa-let-7g在人肝癌细胞HepG2，、Hep3B和Huh7中呈明显低表达状态，而在Bel-7404细胞株中表现为高表达。　　 第二章、Hsa-let-7g靶基因的预测及作用位点检测　　 1.Hsa-let-7g靶基因的预测　　 经过查找Ensemble Genome Brower database，发现hsa-let-7g基因以反义链的形式存在于第3号染色体。为研究hsa-let-7g在人肝癌细胞中的功能，我们对hsa-let-7g的靶基因进行了预测。发现原癌基因c-Myc mRNA的3UTR区域一第138-147位碱基与hsa-let-7g的seed区域有很好的匹配，并且该seed区域在人、牛、猪、大鼠、小鼠及非洲爪蟾6个物种中高度保守。经过在Ensemble Genome Brower database中序列比对分析，hsa-let-7g的成熟序列及其前体序列在24个物种中高度保守。　　 2.Hsa-let-7g作用位点检测　　 综合预测的结果，我们将与hsa-let-7g的seed区域相结合的c-Myc3UTR作用位点及作用位点碱基突变的片段克隆到psiCHECK2质粒上，构建了含hsa-let-7g作用位点的c-Myc3UTR荧光素酶报告系统载体，并同时构建了其作用位点突变的载体作为阴性对照。有研究表明，hsa-let-7g可以与N-Ras基因mRNA的3UTR相结合，调控N-Ras基因的转录后翻译。因此，我们将与hsa-let-7g相结合的N-ras3UTR作用位点克隆到psiCHECK2质粒，构建含hsa-let-7g作用位点的N-ras3UTR荧光素酶报告系统载体作为阳性对照。将克隆好的含有与hsa-let-7g相互作用位点的c-Myc3UTR载体，、c-Myc-3UTR作用位点突变载体和N-Ras3UTR载体与hsa-let-7g或mimicsnegative control共转染HepG2肝癌细胞，检测荧光素酶的活性。结果显示：只有共转染c-Myc3UTR+hsa-let-7g和N-Ras3UTR+hsa-let-7g两组的荧光素酶活性显著下降而其他阴性对照组没有显著性差异，从而用生物学实验的方法证明了hsa-let-7g的seed区域与c-Myc3UTR的第138-147位碱基相结合，即c-Myc是hsa-let-7g的靶基因。　　 第三章、Hsa-let-7g对肝癌细胞增殖作用机制的研究　　 1.Hsa-let-7g抑制肝癌细胞的增殖　　 根据hsa-let-7g在人肝癌中的表达模式，我们选取HepG2和Bel-7404细胞株来探讨hsa-let-7g在肝癌细胞中的生物学功能。由于hsa-let-7g在肝癌细胞HepG2中低表达，我们将hsa-let-7g mimics转染HepG2细胞，分别于转染后的Day1、Day2、Day3、Day4、Day5用MTT实验检测细胞增殖变化。转染hsa-let-7gmimics后48 h，与对照组相比较，HepG2细胞中hsa-let-7g的水平明显升高(p＜0.05)说明成功地转染hsa-let-7g mimics可以特异明显的升高肝癌细胞HepG2中hsa-let-7g水平。从转染后48 h开始，hsa-let-7g mimics可以抑制肝癌HepG2的增殖，其抑制作用持续至转染后第5天。而将hsa-let-7g inhibitor转染hsa-let-7g高表达的Bel-7404细胞72h，与对照组相比较，Bel-7404细胞中hsa-let-7g的水平明显降低(p＜0.05)说明成功地转染hsa-let-7g inhibitor可以特异明显的降低肝癌细胞Bel-7404中hsa-let-7g水平。hsa-let-7g inhibitor将hsa-let-7g抑制后，可促进Bel-7404的增殖，促进增殖作用从转染后72h开始，持续至转染后第5天。由此结果说明，在不同hsa-let-7g表达的肝癌细胞株中，hsa-let-7g从正反两个方面均能调节肝癌细胞的增殖，发挥其抑制肝癌细胞增殖的作用。　　 2.Hsa-let-7g下调原癌基因c-Myc的表达　　 经过预测和实验证明，原癌基因c-Myc是hsa-let-7g的靶基因。经qPCR检测，发现与正常肝细胞LO2相比，肝癌HepG2和Bel-7404细胞中原癌基因c-Myc的mRNA表达明显升高了至少6倍。　　 3.Hsa-let-7g对肝癌细胞蛋白质组表达的影响：　　 为了进一步研究hsa-let-7g对肝癌细胞增殖的具体机制以及其对肝癌细胞蛋白质组表达的影响，我们对转染了hsa-let-7g mimics和mimics negative control的HepG2细胞进行二维电泳，检测其蛋白质组表达变化。　　 4.Hsa-let-7g下调原癌基因Bmi-1的表达：　　 综合上述实验结果，我们发现hsa-let-7g通过调节原癌基因c-Myc和抑癌基因p16的表达从而调节肝癌细胞的增殖。　　 第四章、斑马鱼肝癌研究模型的构建　　 为进一步在体内研究hsa-let-7g及其它miRNA的功能，我们以斑马鱼为模式生物，建立了斑马鱼肝癌研究模型。将线性化的pcDNA3.0+DsRed质粒转染人肝癌细胞HepG2后，将转染了pcDNA3.0+DsRed红色荧光质粒的HepG2细胞用显微注射的方法注射进入发育了2天的转基因斑马鱼flk1：GFP幼鱼的卵黄内。结果发现，注射进入幼鱼的肝癌细胞能够从斑马鱼肠下血管诱导血管生成，说明人肝癌细胞在斑马鱼体内存活，并诱导了斑马鱼的血管生成，斑马鱼肝癌体内研究模型构建成功。　　 结论及研究意义：　　 1.原癌基因c-Myc是hsa-let-7g的靶基因　　 经实验证实，let-7家族成员之一，hsa-let-7g的seed区域与c-Myc3UTR的第138-147位碱基相作用，即原癌基因c-Myc是hsa-let-7g的靶基因。　　 2.Hsa-let-7g通过调节c-Myc-Bmi-1-p16通路抑制肝癌细胞的增殖　　 本研究首次发现：在人肝癌细胞中，hsa-let-7g能够通过直接下调原癌基因c-Myc、间接下调原癌基因Bmi-1及间接上调抑癌基因p16来抑制肝癌细胞的增殖，即hsa-let-7g参与了肝癌细胞中c-Myc-Bmi-1-p16通路的调节。　　 3.成功建立斑马鱼肝癌体内研究模型　　 本研究建立了斑马鱼肝癌体内研究模型，这是国内外首次应用显微注射的方法将带有荧光标记的人肝癌细胞注射入斑马鱼体内，建立斑马鱼异源肝癌体内研究模型。