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本课题的目的是研究蛇床子素的体内和体外抗炎活性,并进一步探讨其对炎症信号通路的调控机制,阐释其发挥抗炎活性的分子机理。
本实验采用了角叉菜胶导致大鼠足趾肿胀,以及二甲苯导致小鼠耳肿胀的方法,构建了两个动物炎症模型进行体内实验,以此来评估蛇床子素在体内对急性炎症反应的抑制作用。结果表明:10mg/kg和20mg/kg浓度的蛇床子素,在一定程度上对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的炎症反应中起到了抑制作用;同时,浓度为40mg/kg的蛇床子素在二甲苯致小鼠耳肿胀的炎症反应中有显著抑制作用。
通过体外试验,用LPS刺激小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),导致多种炎症介质的释放,包括常见的TNF-α、IL-6、NO等炎症因子,并以此来探索蛇床子素如何抑制巨噬细胞炎症介质的释放。采用ELISA检测炎症因子TNF-α和IL-6的含量,采用Griess法检测NO的含量,并且利用MTT法来评估细胞毒性。运用Western blot蛋白检测技术检测如下蛋白水平:iNOS蛋白、β-actin(内参蛋白)、COX-2蛋白、IκB-α蛋白、p-p38蛋白、p-ERK蛋白和p-JNK蛋白;通过基于NF-κB和MAPKs的炎症信号通路,以此来探究蛇床子素所发挥的作用及机理。采用比色法来检测COX-2的酶活性。总体上说,本文主要形成如下研究结果:蛇床子素在12.5~100μM的浓度范围内,具有明显抑制LPS诱导RAW264.7释放炎症介质(TNF-α、IL-6、NO)的作用,且呈现出了较好的剂量依赖性关系。通过比色法测定的酶活性结果,充分说明蛇床子素没有很强的抑制COX-2酶活性的作用。Western blot蛋白检测结果显示,蛇床子素具有明显下调iNOS和COX-2蛋白表达水平的作用。进一步研究表明,用不同浓度的蛇床子素处理可以显著降低MAPK/p38蛋白的磷酸化,但是并未能明显地抑制MAPK/JNK与MAPK/ERK蛋白磷酸化。LPS的刺激诱导使IκB-α蛋白在15分钟内降解,通过100μM的蛇床子素进行处理,使IκB-α蛋白完全恢复。未治疗组、LPS组和蛇床子素治疗组之间结果的差异表明,蛇床子素通过使NF-?B信号通路失活来减轻炎症。
综上所述,利用上述动物炎症模型,验证了蛇床子素具有体内抗炎活性的功能。通过体外研究表明,蛇床子素在抑制LPS诱导RAW264.7分泌多种炎性因子方面具有一定的积极作用;同时可一定程度上抑制COX-2蛋白、iNOS蛋白的高表达,并且进一步阻断MAPK/p38的磷酸化,从而达到抗炎的作用。通过以上实验为蛇床子素的临床转化及应用提供了一定的科学依据。
本实验采用了角叉菜胶导致大鼠足趾肿胀,以及二甲苯导致小鼠耳肿胀的方法,构建了两个动物炎症模型进行体内实验,以此来评估蛇床子素在体内对急性炎症反应的抑制作用。结果表明:10mg/kg和20mg/kg浓度的蛇床子素,在一定程度上对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的炎症反应中起到了抑制作用;同时,浓度为40mg/kg的蛇床子素在二甲苯致小鼠耳肿胀的炎症反应中有显著抑制作用。
通过体外试验,用LPS刺激小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),导致多种炎症介质的释放,包括常见的TNF-α、IL-6、NO等炎症因子,并以此来探索蛇床子素如何抑制巨噬细胞炎症介质的释放。采用ELISA检测炎症因子TNF-α和IL-6的含量,采用Griess法检测NO的含量,并且利用MTT法来评估细胞毒性。运用Western blot蛋白检测技术检测如下蛋白水平:iNOS蛋白、β-actin(内参蛋白)、COX-2蛋白、IκB-α蛋白、p-p38蛋白、p-ERK蛋白和p-JNK蛋白;通过基于NF-κB和MAPKs的炎症信号通路,以此来探究蛇床子素所发挥的作用及机理。采用比色法来检测COX-2的酶活性。总体上说,本文主要形成如下研究结果:蛇床子素在12.5~100μM的浓度范围内,具有明显抑制LPS诱导RAW264.7释放炎症介质(TNF-α、IL-6、NO)的作用,且呈现出了较好的剂量依赖性关系。通过比色法测定的酶活性结果,充分说明蛇床子素没有很强的抑制COX-2酶活性的作用。Western blot蛋白检测结果显示,蛇床子素具有明显下调iNOS和COX-2蛋白表达水平的作用。进一步研究表明,用不同浓度的蛇床子素处理可以显著降低MAPK/p38蛋白的磷酸化,但是并未能明显地抑制MAPK/JNK与MAPK/ERK蛋白磷酸化。LPS的刺激诱导使IκB-α蛋白在15分钟内降解,通过100μM的蛇床子素进行处理,使IκB-α蛋白完全恢复。未治疗组、LPS组和蛇床子素治疗组之间结果的差异表明,蛇床子素通过使NF-?B信号通路失活来减轻炎症。
综上所述,利用上述动物炎症模型,验证了蛇床子素具有体内抗炎活性的功能。通过体外研究表明,蛇床子素在抑制LPS诱导RAW264.7分泌多种炎性因子方面具有一定的积极作用;同时可一定程度上抑制COX-2蛋白、iNOS蛋白的高表达,并且进一步阻断MAPK/p38的磷酸化,从而达到抗炎的作用。通过以上实验为蛇床子素的临床转化及应用提供了一定的科学依据。