目的:补骨脂素(psoralen)是临床常用中药补骨脂的主要活性成分。近年来,有关补骨脂素具肝脏毒性的报道日益增多,但其致毒机理并不明确。本文主要探讨补骨脂素肝毒性及其对肝脏胆汁酸合成转运的影响,以期阐明补骨脂素在体内产生肝脏毒性的作用机制。方法:本研究以鼠为试验对象,补骨脂素灌胃给药不同天数后,对有关指标进行检测和分析,确定补骨脂素在体内具有肝脏毒性的作用。1.动物给药:实验初期以Sprague Dawley大鼠为研究对象,将48只大鼠随机分为4组:对照组、给药1 d组、给药3 d组和给药7 d组,每组12只。之后再以C57/BL6J小鼠为研究对象,将80只小鼠随机分为4组:对照组、给药3 d组、给药7 d组和给药14 d组,每组20只,雌雄各半。给药组给予补骨脂素溶液,对照组给予相同体积的溶剂,每日灌胃一次。末次给药后,禁食不禁水12 h,收集血清和肝脏样本。2.肝损伤指标检测:比较鼠给药前后体重、肝重以及肝脏系数的变化;测定ALT、AST、TBA等血清生化指标;肝脏匀浆检测肝脏TBA等生化指标;H&E染色观察鼠的肝脏组织病理学变化。3.肝损伤机制探究:Real-time PCR检测胆汁酸转运体(NTCP、BSEP、MRP2等)基因表达,Western blot检测胆汁酸合成酶及转运体(CYP7A1、NTCP、BSEP、MRP2等)蛋白表达,围绕胆汁酸合成、转运等方面讨论补骨脂素破坏肝内胆汁酸、胆固醇稳态平衡的机理。4.建立LC-MS/MS测定小鼠肝脏中24种胆汁酸含量的分析方法,并测定对照组和补骨脂素给药14 d组小鼠肝脏中24种胆汁酸的含量,分析补骨脂素对肝内胆汁酸代谢的影响。结果:1.与对照组相比,补骨脂素灌胃给药1、3、7 d,大鼠肝脏重量均显著增大,肝脏系数也明显升高。给药3 d血清中ALT和AST明显升高,给药7 d肝组织病理学显示肝细胞出现凝固性坏死灶、胆管破坏或增生。Real-time PCR和Western Blot实验结果发现补骨脂素能明显抑制BSEP、MRP2、OSTα等胆汁酸外排转运体,同时显著增加胆汁酸摄取转运体NTCP的蛋白含量。2.与对照组相比,补骨脂素灌胃给药3、7、14 d,小鼠肝脏系数、肝功能指标以及肝脏H&E染色均发生病理性变化,出现了不同程度的肝损伤。其中肝组织病理学发现补骨脂素7 d组肝细胞总坏死数雌性比雄性多,14 d组雌性小鼠肝细胞总坏死数减少,此时雄性较雌性多。同时发现雄性小鼠给药3 d组肝脏匀浆中TBA的含量较对照组明显升高。Western Blot实验结果表明,补骨脂素可促进胆固醇合成酶HMGCR,并抑制胆汁酸合成酶CYP7A1、CYP27A1及胆汁酸外排蛋白BSEP、OSTα等的表达。3.实验成功建立了LC-MS/MS测定小鼠肝脏中24种胆汁酸的分析方法。经研究发现:雌性小鼠给药14 d组ALCA含量较对照组显著升高,DCA、β-MCA和APCA的含量较对照组均显著下降,其余类型胆汁酸均无明显变化;雄性小鼠给药14 d组,UCA含量显著下降,而Mo CA、UDCA、HDCA、β-MCA、12-DHCA、UCA、ALCA、CA、TUDCA、TDCA、ω-TMCA、β-TMCA和TCA的含量均有不同程度的升高,并且与对照组相比有显著性。结论:1.补骨脂素灌胃给药3 d能使大鼠产生明显的肝脏毒性,同时改变了胆汁酸转运体基因和蛋白的表达,破坏了肝脏胆汁酸稳态平衡。2.补骨脂素能够影响小鼠肝内胆固醇-胆汁酸合成转运相关蛋白的表达,使肝细胞内胆汁酸含量增多,表现出明显的肝脏损伤,且雌雄小鼠肝损伤严重程度的达峰时间不一致。3.补骨脂素灌胃给药14 d雄性小鼠肝内所测24种胆汁酸的总含量明显升高,而雌性小鼠明显下降。4.本研究确定了补骨脂素可影响肝内胆汁酸的合成、转运、排泄及代谢等途径,推测其通过影响肝脏胆汁酸合成转运平衡,从而表现出一系列肝损伤的指征。