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目的:通过microRNA干扰技术抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞MTDH的表达,观察其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、转移、侵袭能力的影响,探讨MTDH基因在乳腺癌细胞MDA-MB-231生物学行为中的作用,为MTDH-miRNA的个性化、靶向性治疗乳腺癌提供实验及理论依据。方法:1.质粒构建、测序、提纯及转染:根据GenBank提供的MTDH基因序列设计4条RNA干扰序列,并设计1条非特异性序列作为阴性对照。将4条RNA干扰序列分别与miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR连接,构建重组质粒载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-MTDH,命名为MTDH-miRNA1、MTDH-miRNA2、MTDH-miRNA3、MTDH-miRNA4,该重组质粒载体由上海Invitrogen公司构建并鉴定测序。测序成功后将含有靶向MTDH的miRNA质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-MTDH提纯,瞬时转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,并检测转染率。2.验证及选择最佳干扰组:通过Western blot检测MTDH蛋白、RT-PCR检测MTDHmRNA,验证4条miRNA-MTDH对MTDH表达的抑制作用,并选择出一条对MTDH基因表达抑制效果最佳的一组,以作进一步实验。3.检测抑制MTDH基因后乳腺癌细胞增殖、转移、侵袭能力:将乳腺癌MDA-MB-231细胞分为三组,分别为未转染组、空载体转染组、转染组。应用MTT检测法、划痕实验、Transwell实验,分别检测各组细胞增殖、转移、侵袭能力。4.统计学分析:对未转染组、空载体转染组、转染组的MTT检测法、划痕实验、Transwell实验的结果进行统计学分析,确定各组细胞增殖、转移、侵袭能力及差异有无显著性。结果:1.重组质粒载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-MTDH-miRNA经DNA测序分析证明构建成功。pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-MTDH-miRNA重组质粒提取后琼脂糖凝胶电泳跑胶结果表示质粒提取纯度较高。瞬时转染后,在荧光显微镜下观察可见转染细胞内的绿色荧光,转染率达80%。2.Western blot结果显示,与未转染组相比,转染MTDH-miRNA14的人乳腺癌MDA-MB-231细胞内MTDH蛋白表达水平分别下降了27.45%、34.31%、59.80%、79.41%,其中对MTDH蛋白表达的抑制最明显是MTDH-miRNA4转染组（P<0.05）,而空载体转染组与未转染组相比,MTDH蛋白表达水平下降了2.94%,差异无显著性（P>0.05）。3.RT-PCR结果显示,与未转染组相比,转染MTDH-miRNA14的人乳腺癌MDA-MB-231细胞内MTDHmRNA水平分别下降了15.74%、20.37%、38.89%、80.56%,其中MTDH-miRNA4转染组对MTDHmRNA表达抑制干扰最明显（P<0.05）,而空载体转染组与未转染组相比,MTDHmRNA水平下降了3.70%,差异无显著性（P>0.05）。4.MTT结果显示,肿瘤细胞生长24h后,未转染组、空载体转染组、MTDH-miRNA4转染组的OD值分别为0.3800±0.033、0.3699±0.041、0.2891±0.020;肿瘤细胞生长48h后,未转染组、空载体转染组、MTDH-miRNA4转染组的OD值分别为0.4450±0.021、0.4140±0.022、0.3311±0.032;肿瘤细胞生长72h后,未转染组、空载体转染组、MTDH-miRNA4转染组的OD值分别为0.5600±0.012、0.5200±0.023、0.3912±0.000;肿瘤细胞生长96h后,未转染组、空载体转染组、MTDH-miRNA4转染组的OD值分别为0.7100±0.011、0.6810±0.010、0.4622±0.010,结果表明转染组较未转染组、空载体转染组明显减慢（P<0.05）,而未转染组与空载体转染组相比差异无显著性意义（P>0.05）,提示MTDH是人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的重要因素。5.划痕实验结果显示,在划痕后24h,未转染组、空载体转染组、MTDH-miRNA4转染组的细胞迁移距离分别为4.8±0.2、5.0±0.5、0.3±0.2;在划痕后48h,未转染组、空载体转染组、MTDH-miRNA4转染组的细胞迁移距离分别为6.2±0.1、5.7±0.4、0.5±0.7,结果表明转染组较未转染组和空载体转染组迁移运动能力明显减弱,差异具有统计学意义（P<0.05）,提示MTDH-miRNA转染的人乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移能力被抑制。6.Transwell实验结果显示,5个高倍视野穿过基质胶的细胞数,未转染组为55.00±4.58个,空载体转染组为48.67±3.51个,转染组为10.67±2.08个,转染组穿过基质胶的细胞数目明显少于未转染组和空载体转染组,具有统计学意义（P<0.05）。结果表明,将MTDH基因沉默可降低人乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外侵袭能力。结论:1.重组质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-MTDH-miRNA表达载体瞬时转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞后可明显抑制乳腺癌细胞中MTDH表达。2.microRNA抑制MTDH表达后,可使人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长增殖受到明显抑制,提示MTDH是人乳腺癌细胞增殖的重要因素。3.microRNA抑制MTDH表达后,可使人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭能力明显减弱,提示MTDH与人乳腺癌细胞的侵袭转移有关。