芫花(Genkwa Flos)是中国特有的瑞香科植物Daphnegenkwa Sieb.et Zucc.的干燥花蕾,临床应用历史悠久。现代研究表明芫花具有广泛的药理作用:镇咳、祛痰、镇痛、抑菌、抗炎、抗惊厥、抗肿瘤等。其广泛的生物学活性和潜在的抗肿瘤活性,使其有望成为常用的辅助性治疗药物,将来可能与其它药物合用的机率越来越大。但有研究发现长期大剂量使用芫花可致肝、肾、脑等器官出现严重损伤,并且芫花对皮肤及黏膜具有严重的刺激性。有研究表明芫花中的二萜原酸酯类成分既是芫花的生物活性成分又是致毒的主要物质。长久以来,芫花的毒性使其在临床应用受到很大的限制。目前,对于芫花的毒性研究主要集中在毒性物质基础的发现,而其致毒机制的研究尚不多见。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)是体内重要的Ⅱ相代谢酶之一,主要分布于肝脏、肠道、肾脏等器官。其功能是催化内源性物质、外源性化合物及毒性代谢物转化为极性较强的结合物,经肾脏排出体外。因此,UGTs的数量和活性直接影响药物在体内的代谢消除,UGTs介导的代谢是外源物在体内重要的解毒途径,对维持机体的稳定及药物发生药效至关重要。曾有研究报道芫花对细胞色素CYP450酶活性的影响,而其对Ⅱ相代谢酶UGTs活性的影响研究,目前尚未见报道。鉴于此,本文重点考察了芫花及其主要成分对肝脏UGTs活性的影响,并推测芫花致肝毒性的两条可能途径。文中分别以4-硝基酚(4-NP)、雌二醇和胆红素为探针底物,采用UV、HPLC和UPLC-MS的方法,测定单位时间单位蛋白浓度下底物的消耗量或代谢物的生成量,以此作为判断酶活性的指标,用于考察芫花及其主要成分对UGTs、UGT1A1活性的影响。实验研究如下:1体外UGT1A1酶活性测定条件的优化本部分选择UGT1A1的探针底物雌二醇,以单位时间单位蛋白浓度生成的代谢产物量考察酶活性。首先建立了雌二醇代谢产物在肝微粒体孵育体系中的HPLC分析方法,结果表明建立的方法可靠、专属性强、精密度、回收率及定量限均符合生物样品测定要求,该方法满足雌二醇代谢产物在后续研究中的定量要求,并确定最终温孵时间为30 min,蛋白浓度0.5 mg·mL-1用于酶动力学分析。2芫花及其主要成分对肝微粒体UGTs、UGT1A1活性影响的体外实验研究2.1芫花主要成分的含量测定利用乙醇加热回流提取法制备得到芫花醇提物,萃取得到氯仿萃取物,采用HPLC方法对两者中的3种黄酮类成分(芫花素、芹菜素及羟基芫花素)进行含量测定,芫花醇提物中芹菜素、羟基芫花素和芫花素分别占6.34%、8.72%、6.06%;氯仿萃取物中芹菜素、羟基芫花素和芫花素分别占1.00%、6.40%、18.38%;比色法测定两者中的总二萜含量分别为30.72%和36.33%。本章为后续考察芫花及其主要成分对酶活性的影响提供基础。2.2芫花及其主要成分对肝微粒体UGTs活性的影响本实验以4-NP为探针底物,采用UV法测定其剩余量,评价各成分对体外肝微粒体(MLM、RLM、HLM)中UGTs活性的影响,结果表明芫花及其主要成分对UGTs的活性均有不同程度的抑制作用,且在MLM、RLM、HLM三种体系中芫花醇提物对UGTs活性的抑制作用较其它成分都强,且抑制作用具有种属差异性。2.3芫花及其主要成分对肝微粒体UGT1A1活性的影响2.3.1芫花及其主要成分对RLM中UGT1A1活性的影响本节实验以雌二醇为探针底物,采用HPLC法测定雌二醇代谢产物含量的变化,评价了芫花醇提物、氯仿萃取物和羟基芫花素对RLM中UGT1A1活性的影响。芫花醇提物、氯仿萃取物和羟基芫花素对RLM中UGT1A1均有中等强度的抑制作用,抑制类型分别为竞争性抑制(Ki=4.62μM)、非竞争性(Ki=28.3μM)和竞争性抑制(Ki=32.3 μM),抑制强弱为:氯仿萃取物(IC50=8.76μM)>羟基芫花素(IC50=10.93 μM)>芫花醇提物(IC50=46.32 μM)。2.3.2芫花及其主要成分对HLM中UGT1A1活性的影响本节实验以雌二醇为探针底物,采用HPLC法测定雌二醇代谢产物含量的变化,评价了芫花醇提物、氯仿萃取物和羟基芫花素对HLM中UGT1A1活性的影响;另外以胆红素为探针底物,采用UPLC-MS法测定胆红素代谢产物含量的变化,评价了芫花素和芹菜素对HLM中UGT1A1活性的影响。结果显示,芫花醇提物和氯仿萃取物对HLM中UGT1A1的活性均表现为中等强度的抑制作用,且都为反竞争性抑制类型(Ki分别为 1.464 μM、46.90 μM),抑制强弱顺序:氯仿萃取物(IC50-10.36 μM)>芫花醇提物(IC50=32.49 μM)。羟基芫花素、芫花素和芹菜素是芫花中主要的3种黄酮类化合物,羟基芫花素对HLM中的UGT1A1具有弱抑制作用,而芫花素和芹菜素则表现为中等强度的抑制作用,三者均为竞争性抑制作用(Ki分别为:22.45 μM、16.47 μM、4.080μM),抑制强弱顺序:芹菜素(IC50=12.40μM)>芫花素(IC50=23.21μM)>羟基芫花素(IC50-76.31 μM)。2.3.3芫花及其主要成分对rhUGT1A1活性的影响本节实验采用与前两节相同的方法考察了芫花醇提物和羟基芫花素对rhUGT1A1活性的影响。结果显示,芫花醇提物和羟基芫花素均中等强度的抑制UGT1A1的活性,抑制类型分别为竞争性抑制(Ki=5.59 μM)和混合型抑制(Ki=3.44 μM,αKi=73.33,α=21.33),抑制强弱顺序:芫花醇提物(IC50=8.382μM)>羟基芫花素(IC50=20.07 μM);该结果与前两节实验中两者对UGT1A1的活性都有抑制作用的结果相同,但抑制类型和抑制强弱不同,再次验证了肝脏代谢酶存在种属差异,使得药物作用于不同种属UGT1A1时,呈现出不同的效果。3芫花及其主要成分体内对大鼠肝脏UGTs、UGT1A1活性的影响本部分实验分别采用芫花醇提取物(0.25g·kg-1·d-1、0.05 g·kg-1·d-1)、芫花氯仿萃取物(0.25 g·kg-1·d-1、0.05 g·kg-1·d-1)连续7d灌胃诱导大鼠,及羟基芫花素(100 mg·kg-1·d-1)连续7d腹腔注射诱导大鼠,制备肝微粒体,考察各成分对UGTs、UGT1A1活性的影响。结果表明,芫花醇提物、氯仿萃取物和羟基芫花素均能显著抑制大鼠体内UGTs酶的活性,与体外实验结果一致。芫花提取物体内诱导大鼠后,肝微粒体UGT1A1活性增强,呈诱导趋势,但与空白组相比并无显著性差异;羟基芫花素组大鼠肝微粒体中UGT1A1酶活性稍有下降,但与空白对照组相比也无显著性差异。综上所述,芫花及其主要成分(乙醇及氯仿提取物、黄酮类成分)在体内外均可显著抑制UGTs的活性。现有文献表明芫花二萜原酸酯类成分具有直接的肝细胞毒性作用,并且在体内存在Ⅱ相代谢解毒过程,因此推测芫花及其主要成分对UGTs活性的抑制可能阻碍毒性成分(二萜类)的Ⅱ相解毒过程,从而使毒性成分和次生毒性代谢物在体内蓄积,发生毒性反应,这可能是芫花致毒的重要机制之一。同时芫花主要成分对UGT1A1也呈一定的抑制作用,提示我们芫花可能扰乱体内内源物胆红素的代谢,引起高胆红素血症,严重时可致肝细胞损伤;同时,芫花对UGTs、UGT1A1活性的影响,也提示我们临床应用芫花时要警惕其潜在的药物-药物相互作用。另外,芫花及其主要成分对UGT1A1活性影响的体内外结果不同,分析原因可能为:药物在复杂的体内环境下经过一系列的代谢转化后,作用于UGT1A1酶的物质与体外温孵体系中的成分有很大差别,最终导致不同结果。