基于EST模型的全氟烷基化合物致心肌发育毒性作用及其定量蛋白质组学研究

被引量 : 0次 | 上传用户:limingxing0623
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
胚胎干细胞测试(embryonic stem cell test. EST)体系以胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)分化为心肌细胞模型为基础,是欧洲代替方法验证中心(the European Center for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)提出的作为体外筛选和评价受试物(包括药物或环境中化合物等)可能具有的发育毒性手段。该体系能基本模拟乃至重现体内心肌分化和发育复杂全程,富含大量心肌发育依赖性生物信息,与体内毒性实验相比,具有对药物作用反应迅速、干扰因素少、敏感性高等优点。全氟烷基化合物(Polyfluorinated Alkyl Substances, PFAS)被广泛应用于工业生产和人类消费,包括全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane Sulfonate, PFOS),全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid, PFOA),全氟丁基磺酸(Perfluorobutane Sulfonate, PFBS)等。该类化合物大量使用致使其以各种途径进入全球范围内各种环境介质如水体、土壤、大气中,并通过食物链传递放大生物效应,目前在人体以及许多动物组织中均发现浓度较高PFOS和PFOA存在。这类化合物在自然环境和生物体内具不分解性和很高的生物积累能力,其所造成的全球性生态污染已成事实,这是直接关系到人类健康的重要问题。已有文献报道PFOS具有发育毒性、生殖毒性、心血管毒性、神经毒性等多重毒性效应,被认为是一类具有全身多脏器毒性化合物。虽然研究者已经掌握了一些关于PFOS发育毒理学研究资料,但还处于初始阶段,且多限于动物实验。PFOS引起的发育毒性作用机制和敏感指标还远未完全清楚。氨基酸进行稳定同位素标记(Stable Isotope Labeling with Amino Acidsin Cell Cultures, SILAC)是近年来发展起来的比较蛋白组学新方法,可以对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定分析,快速找出重要功能蛋白质。目前尚未见利用EST系统预测全氟烷基化合物对心肌发育毒性作用研究报道,也未见利用SILAC标记定量蛋白质组学技术研究该类化合物毒性作用机制,亟待深入探索加以论证。基于上述背景,本学位论文主要利用EST模型从细胞毒性、分化抑制、基因蛋白表达不同水平系统论证全氟烷基系列化合物PFOS、PFOA和PFBS心肌发育毒性作用强弱等级及构效关系。为进一步重点考察PFOS对心肌发育毒性作用的具体分子机制,我们采用SILAC标记的蛋白组学方法定量研究PFOS干预ES细胞定向分化心肌细胞前后差异表达蛋白图谱。采用GO分类方法探讨差异蛋白的细胞位置、基因参与的生物过程、发挥的分子功能,通过Pathway分析PFOS对不同通路的影响,通过Network分析差异基因的网络互作关系,并采用Western Blot法对差异蛋白予以验证。研究结果将有利于揭示PFOS引起心肌发育毒性作用的早期分子事件和毒性敏感指标。同时有利于将EST作为一种有效的毒性评价体系在化合物成药性或环境毒物对心肌毒性预测性评估中的推广应用。目的:利用EST模型从细胞毒性、分化抑制、基因蛋白表达不同水平评价全氟烷基化合物PFOS、PFOA和PFBS对小鼠胚胎干(Mouse Embryonic Stem, mES)细胞定向分化为心肌细胞的发育毒性作用,分析该类化合物致心肌发育毒性的构效关系。并利用SILAC标记的定量蛋白质组学探讨PFOS致心肌发育毒性作用机制。方法:利用经典的悬滴培养法建立EST模型,加入不同浓度的青霉素、DPH、5-FU以及全氟烷基化合物PFOS、PFOA和PFBS,检测受试物对mES定向心肌分化能力的影响获得产生50%mES细胞分化抑制作用的浓度ID50D3;采用MTT法检测受试物对ES细胞和3T3细胞的细胞毒性获得产生50%细胞毒性作用的浓度IC50D3和IC503T3,经发育毒性计算公式计算,并依据发育毒性判定标准评定受试物的发育毒性等级,并分析全氟烷基化合物致心肌发育毒性构效关系。利用SILAC定量蛋白质组学技术考察PFOS干预ES细胞定向分化心肌细胞前后差异表达蛋白图谱,分别用含轻型稳定同位素(天然稳定同位素)和重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基,对mES分别进行培养,待细胞标记完全后(标记率90%以上),将经过轻、重型同位素标记的两组细胞进行悬滴、悬浮、贴壁培养,设定轻型同位素标记细胞为溶剂对照组,重型同位素标记细胞用PFOS处理。化合物处理10天后收集样本,分别提取蛋白等比例混合后经SDS-PAGE分离,酶解提取肽,进行质谱检测,通过质谱图上每对轻重稳定同位素峰比例可反映对应蛋白在PFOS作用后的表达变化。根据每个鉴定蛋白至少包含两段鉴定多肽,且溶剂对照组(DMSO)和实验组(PFOS)差异1.5以上的标准来筛选差异蛋白。用Gene Ontology annotations软件对差异蛋白进行功能分类,通过网络数据分析以及文献查阅来确定差异蛋白的功能,揭示PFOS致心肌发育毒性部分作用靶标。基于蛋白组学的结果,选取了活性氧信号通路以及OCT4甲基化方面与PFOS心肌发育毒性作用的相关性进行了探讨。主要利用Western Blot方法和RT-PCR方法进行重要蛋白的验证。通过DCF-DA检测PFOS作用后拟胚体EBs内ROS含量。结果:通过EST模型评价了青霉素(Penicillin G)、苯妥英(Phenytoin, DPH、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)心肌发育毒性,三者IC50D3依次为6981、246和0.36μM, IC503T3分别为6370、240和0.45μM, ID50D3分别为4626、99和0.31μM,心肌发育毒性等级分别为一级、二级、三级,结果与文献报道一致,该模型通过有效性验证,适用于全氟烷基化合物PFBS、PFOA和PFOS心肌发育毒性评价。受试化合物PFBS、PFOA和PFOS的IC50D3依次为4139、470和291μM, IC503T3分别为5980、484和435μM, ID50D3分别为808、223和40μM,心肌发育毒性等级分别为一级、二级、二级。三者心肌发育毒性强弱顺序为PFOS>PFOA>PFBS,且具有一定构效关系,即碳链越长心肌发育毒性越大,末端磺酰化心肌发育毒性大于未磺酰化。从形态上观察,PFOS作用ES细胞后,影响拟胚体(embryoid bodies, EBs)形态,浓度越大,EBs半径越小。RT-PCR检测结果显示,随着PFOS浓度增加,中胚层基因Brachury及心肌特异性基因a-MHC表达下降,且呈浓度依赖性。Western blot方法检测结果显示,PFOS使心肌特异性转录因子GATA4、MEF2C呈浓度依赖性表达下调。流式细胞术定量检测PFOS使表达心肌特异性蛋白a-actinin的心肌细胞数量呈浓度依赖性下调。SILAC标记蛋白质组学分析结果显示,PFOS作用后与溶剂对照组比较,mES分化为心肌细胞蛋白质表达图谱存在明显差异。共筛选出176个差异蛋白,PFOS作用后67个蛋白上调和109个蛋白下调。对差异蛋白进行GO分析显示,在分子功能方面有13个分类,在细胞定位方面有12个分类,在细胞生物学过程方面有10个分类。将差异蛋白对应基因进行KEGG通路分析,共筛选到31个统计学上有显著意义的信号通路,主要涉及参与信号转导、脂代谢、能量代谢及酶代谢相关通路。在网络分析图中,差异蛋白对应基因与基因组中其他基因的相互作用共涉及到118个蛋白1296个相互作用,其中与发育相关差异基因与其他基因的相互作用涉及32个蛋白469个相互作用。基于上述蛋白组学结果,选取了活性氧信号通路以及OCT4甲基化方面探讨相关毒性作用机制。对差异蛋白Dnmt3b、Dnmt3a、SOD2、Hsp27、MYH10及其相关蛋白进行验证,PFOS作用后Dnmt3b、Dnmt3a蛋白表达呈下调趋势,Dnmt3b在第3、5、6d均有明显下调,而Dnmt3a在第6d明显下调,而OCT4在第5、6d上调。PFOS使SOD2、Hsp27上调,SOD在第3、5d上调明显,Hsp27的磷酸化形式在全程均成上调趋势,致使在心肌分化过程中ROS减少,导致ERK1/2. p38MAPK磷酸化降低,进而使下游GATA4、MEF2C. α-MHC, α-actinin、MYH10表达下调。结论:1.基于EST体系测得PFOS.PFOA. PFBS心肌发育毒性分别为二级、二级、一级,心肌发育毒性强弱顺序为PFOS>PFOA>PFBS,构效关系为碳链越长心肌发育毒性越大,末端磺酰化心肌发育毒性大于未磺酰化。2.通过SILAC标记的定量蛋白组学构建了PFOS对ES细胞定向分化为心肌细胞蛋白质差异表达图谱,通过质谱共鉴定出176个差异蛋白,其中67个蛋白上调和109个蛋白下调。差异蛋白涉及31个生化和信号通路,蛋白质相互作用网络图中共包含118个蛋白1296个相互作用。3. PFOS持续作用使清除活性氧相关蛋白SOD2、Hsp27表达增加,EBs中ROS含量降低,致使p38MAPK通路活化受阻,从而抑制心肌分化。另一方面,PFOS可使DNA甲基转移酶下调,致使OCT4沉默受阻,从而抑制了ES细胞的分化启动进程。
其他文献
卢托斯拉夫斯基作为波兰最具代表的先锋派作曲家,以他独具特色的音乐风格,和其特有的“有限定的偶然“创作技法,在二十世纪国际乐坛上占有重要的地位。在他的作品中,既感受不
沙漠化地区除了生态环境脆弱外,同时也拥有着丰富的旅游资源,并以其粗犷、古朴、原始、神秘美感具有极大的吸引力,也以其丰富、独特、多样的旅游资源尤为著称,逐渐受到人们的青睐
随着我国社会与经济的发展,各类刑事犯罪案件层出不穷,未成年人犯罪的案件也呈逐年递增的趋势,于是附条件不起诉这一针对未成年人犯罪的司法制度应运而生。这一规定响应了国
目的:研究雌激素(ER)、孕激素(PR)受体及Her-2受体在乳腺癌复发和转移灶之间的表达差异,探讨其临床意义。方法:收集65例复发、转移的乳腺癌病例,运用免疫组织化学方法检测ER
连环画是我国传统艺术表现形式中的一种,其历史渊源、对中国历史与文化的传承起到了积极的作用。随着历史的更替,新中国的建立及发展,连环画这种艺术表现形式经历了政治、经济、
汽车NVH性能的好坏,是新上市车型的重要评价指标,虽然解决汽车NVH问题需要大量的人力和花费巨大的资金,但是很多汽车厂商及研究机构都愿意就NVH性能提升给予投入,由此汽车NVH性能
继电保护是电力系统安全运行的第一道防线,离线整定计算得到的保护定值往往是根据最大运行方式确定保护定值,在最小方式下校验保护性能。电网在实际运行中,可能由于最大运行
选取我院2013年1月~2014年1月我院收治的60例精索静脉曲张患者。随机分为观察组和对照组各30例。观察组采用腹膜后切口,对照组采用腹股沟管切口,观察记录术中精索血管及淋巴
与康德认为只有表现在意识行为中的“形式范畴”才具有先天性不同,胡塞尔认为不论是形式范畴还是质料范畴都具有先天性;先天与后天的区别,表示的正是一般对象与个体对象在本
山西省地质遗迹资源丰富,涵盖六大类型.典型的区域地质背景和特殊的自然环境条件造就其鲜明的特色.但目前保护利用中存在很多问题,其中遗迹破坏严重、资源利用率与资源占有量