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角蛋白是一种不溶性的硬性角蛋白,广泛存在于动物毛发、羽毛等结构中。因角蛋白分子中大量存在的二硫键、氢键、疏水相互作用等分子作用,使角蛋白结构稳定,难以被胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等普通蛋白酶降解。而微生物分泌的角蛋白酶则可以降解角蛋白。全世界每年将产生百万吨级的羽毛废弃物,利用传统的物理、化学手段处理羽毛废弃物,不仅污染环境也破坏了角蛋白的营养物质,难以实现角蛋白废弃物的二次利用。本研究针对以上问题,以实验室驯化的厌氧角蛋白降解菌18D-TA为材料,运用亨盖特厌氧操作技术,对纯化的菌株KD-1进行了系统发育分析和功能评价。运用单因素和正交实验优化了菌株KD-1的产酶条件;运用气相色谱等分析手段测定了羽毛降解产物中的挥发酸组分和含硫化合物;利用扫描电镜观察了羽毛角蛋白降解过程中的物理变化,结合代谢产物分析,对羽毛角蛋白的降解机理进行了初步探讨;利用中空纤维交叉流系统、离子交换层析和尺寸排阻层析,分离纯化了一种角蛋白酶,并对该酶进行了理化性质分析。研究结果如下:(1)菌株KD-116S rRNA全长与Clostridium ultunense BST(=DSM10521T)和Tepidimicrobiumxylanilyticum PML14T(=JCM15035T)的最大相似性分别为95.3%和93.8%。基因组DNA G+C含量为28mol%,全细胞脂肪酸主要成分为C15:0iso,C15:0iso dma,C16:0dma,C16:0,C14:0dma,C11:0dma,C14:0,C17:0iso dma,未检测到细胞所含呼吸醌。根据系统发育树和生理生化特征,将菌株KD-1鉴定为Clostridiaceae新属,命名为Keratinibaculum paraultunense gen. nov., sp.nov.,模式菌株KD-1(=JCM18769T=DSM26752T)。;(2)菌株KD-1在降解羽毛的过程中紧密吸附于羽枝上,并分泌胞外嗜热碱性丝氨酸蛋白酶,但无二硫键还原酶活性。该菌降解羽毛角蛋白的过程中产生巯基化合物、亚硫酸盐、硫酸盐、硫离子和硫化氢等含硫化合物。推测菌株KD-1的菌体细胞和发酵液中的亚硫酸盐在羽毛角蛋白降解过程中起到了二硫键的还原作用,角蛋白酶主要行使蛋白水解的作用;(3)单因素实验和正交实验表明,K. paraultunense KD-1的最适产酶条件为:羽毛10.0g/L,MgSO40.2g/L,尿素2.0g/L,NaCl3.0g/L,K2HPO43.0g/L,KH2PO42.5g/L,维生素14110.0ml,微量元素14110.0ml,培养基初始pH8.0,培养温度55℃。最佳培养条件下角蛋白酶酶活比原始条件提高了21.3%;(4)运用中空纤维柱浓缩,脱盐柱脱盐,阴离子交换层析和尺寸排阻层析,从发酵液上清中分离纯化了一种角蛋白酶,该酶分子量20kDa,最适酶反应pH10.0(50mM, Gly–NaOH buffer),最适酶反应温度80℃,80℃以下热稳定,pH5-11均能保持大部分活性。被EDTA部分抑制,PMSF完全抑制,属于丝氨酸蛋白酶。还原剂反应阳性,金属离子、去污剂和有机溶剂反应阴性。