脂联素(Adiponectin,APN)是由脂肪细胞所分泌的,是一种特异性的脂肪细胞因子,是调节机体代谢的因子之一,APN具有抗糖尿病、抗炎、抗纤维化、抗动脉粥样硬化的作用,同时具有保护血管的生理效应。近年来国内外的多项研究表明,APN可以通过抑制血管内皮细胞的激活、抑制ERS诱导的细胞凋亡、促进内皮细胞的修复等多种途径发挥血管的保护作用,但其具体机制还有待于深入研究。本研究通过建立离体、在体钙化模型,结合病理分析、分子生物学及细胞生物学等技术,阐述APN通过减轻ERS所致的细胞凋亡进而减轻血管钙化的作用,我们设计了以下实验:第一部分脂联素对大鼠血管钙化的抑制作用目的:构建大鼠钙化模型,观察APN对大鼠血管钙化的抑制作用。方法:健康雄性SD大鼠随机分为3组,每组各10只。分别为正常对照组(sham组):给予等量的生理盐水肌注和单纯花生油灌胃;钙化组(VDN组):第一天8时维生素D3(300000U/kg)肌肉注射,尼古丁(25mg/kg)溶于花生油中进行灌胃(8时和18时各一次),第二天起以等量的蒸馏水灌胃;钙化+脂联素(globular Adiponectin,g Ad)组(VDN+g Ad组):模型制作同钙化组,同时舌静脉注射g Ad(1μg·kg-1/日)。三组动物常规饲养6周后称重,用2%戊巴比妥钠麻醉,摘取胸主动脉,结合病理分析(血管组织Von Kossa染色观察血管钙化程度)、胸主动脉钙含量和ALP活性测定观察钙化程度、Real-time PCR和Western blot检测血管平滑肌组织钙化指标OPG、Runx2的基因和蛋白表达。结果:(1)Von Kossa染色显示sham组未见钙质沉积,VDN组血管可见明显的黑色颗粒钙质沉积、部分中膜弹力纤维紊乱断裂,VDN+g Ad组仅可见少量黑色颗粒钙质沉积;与sham组相比,VDN组钙含量和ALP活性明显增高(P<0.01),VDN+g Ad组与VDN组相比,钙含量和ALP活性明显降低(P<0.05)。(2)与sham组相比,VDN组OPG m RNA表达明显减少,Runx2m RNA表达明显增加(P<0.01);VDN+g Ad组与VDN组相比,OPG m RNA表达明显增加,Runx2m RNA表达明显减少(P<0.01)。(3)与sham组相比,VDN组OPG蛋白表达明显减少,Runx2蛋白表达明显增加(P<0.01);VDN+g Ad组与VDN组相比,OPG蛋白表达明显增加,Runx2蛋白表达明显减少(P<0.01),提示g Ad可明显逆转Runx2蛋白表达的上调,脂联素可以减轻血管钙化。结论:g Ad对大鼠血管钙化有抑制作用。第二部分内质网应激诱导的凋亡促进血管钙化目的:采用原代培养的大鼠主动脉平滑肌细胞制备钙化模型,探讨内质网应激诱导的凋亡对血管钙化的促进作用。方法:原代培养大鼠主动脉VSMC,制备钙化模型,随机分为4组:a.VSMC+正常培养(control组)b.VSMC+β-甘油磷酸钠(β-GP组)c.VSMC+TG+β-甘油磷酸钠(TG组)d.VSMC+4-PBA+β-甘油磷酸钠(4-PBA组)结合Von Kossa染色观察细胞钙化、采用细胞钙含量和ALP活性测定观察细胞钙化程度、TUNEL法和Caspase 3活性测定评估VSMC凋亡情况、Real-time PCR和Western blot检测VSMC内质网应激、细胞凋亡、钙化相关指标(GRP78、caspase12、CHOP、OPG、Runx2)的基因和蛋白表达。结果:(1)Von Kossa染色显示细胞钙化模型成功制备;与control组相比,β-GP组和TG组钙含量与ALP活性显著增高(P<0.01),4-PBA组钙含量与ALP活性明显增高(P<0.05);TG组与β-GP组相比,钙含量与ALP活性明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);4-PBA组与β-GP组相比,钙含量与ALP活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)control组偶见TUNEL阳性细胞,与control组相比,β-GP组、TG组TUNEL阳性细胞明显增多(P<0.01),caspase3活性显著升高(P<0.01),4-PBA组TUNEL阳性细胞明显增多、caspase3活性明显升高(分别P<0.05);TG组凋亡细胞较β-GP组明显增多,caspase3活性明显升高(分别P<0.05),4-PBA组较β-GP组TUNEL阳性细胞显著减少、caspase3活性显著降低(P<0.05)。(3)与control组相比,β-GP组和TG组GRP78、CHOP、caspase12及Runx2 m RNA和蛋白表达显著增加,OPGm RNA和蛋白表达显著减少(分别P<0.01);TG组与β-GP组相比,GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表达显著增加,OPGm RNA和蛋白表达显著减少(分别P<0.05),4-PBA组与β-GP组相比,GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表达明显被抑制,OPGm RNA和蛋白表达显著增加(分别P<0.05)。结论:内质网应激诱导的凋亡促进血管钙化。第三部分脂联素在内质网应激致细胞凋亡导致血管钙化中的作用(一)动物体内实验探讨脂联素在内质网应激致细胞凋亡导致血管钙化中的作用目的:采用在体大鼠血管钙化模型,探讨脂联素在内质网应激致细胞凋亡导致血管钙化中的作用。方法:健康雄性SD大鼠随机分为3组,每组各10只,实验分组同实验一。采用胸主动脉钙含量和ALP活性测定观察钙化程度、TUNEL法和Caspase 3活性测定评估VSMC凋亡情况、Real-time PCR和Western blot检测血管平滑肌组织ERS、细胞凋亡、钙化相关指标(GRP78、Caspase12、CHOP、OPG、Runx2)的基因和蛋白表达。结果:(1)与sham组相比,VDN组钙含量和ALP活性明显增高(P<0.01),VDN+g Ad组与VDN组相比,其钙含量和ALP活性明显降低(P<0.05),提示外源性给予脂联素后,血管钙化明显减轻。(2)sham组极少见TUNEL阳性细胞,与sham组相比,VDN组和VDN+g Ad组TUNEL阳性细胞显著增多、caspase3活性显著升高(分别P<0.01),VDN+g Ad组较VDN组TUNEL阳性细胞显著减少、caspase3活性显著降低(分别P<0.05),提示外源性给予脂联素后,平滑肌细胞凋亡明显减少。(3)与sham组相比,VDN组Caspase12、CHOP、GRP78及Runx2 m RNA和蛋白表达显著增加、OPGm RNA和蛋白表达显著减少(分别P<0.01),给予脂联素处理后,GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表达明显被抑制,OPGm RNA和蛋白表达显著增高(P<0.05),提示g Ad处理后可明显逆转GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表达的上调。结论:g Ad可减轻大鼠血管钙化,与抑制内质网应激诱导的细胞凋亡有关。(二)细胞水平验证脂联素抑制内质网应激所致的细胞凋亡减轻血管钙化目的:采用离体原代培养大鼠主动脉VSMC钙化模型,验证脂联素通过抑制内质网应激所致的细胞凋亡减轻血管钙化。方法:原代培养大鼠主动脉VSMC,随机分为6组:a.control组b.g Ad(2μg/ml)组c.β-GP组d.β-GP+g Ad(0.5μg/ml)组e.β-GP+g Ad(1μg/ml)组f.β-GP+g Ad(2μg/ml)组采用细胞钙含量和ALP活性测定判断细胞钙化程度、TUNEL法和Caspase 3活性测定评估VSMC凋亡情况、Real-time PCR和Western blot检测VSMC内质网应激、细胞凋亡、钙化相关指标(GRP78、caspase12、CHOP、OPG、Runx2)的基因和蛋白表达。结果:(1)β-GP组钙含量和ALP活性与control组相比差异性显著(P<0.01),与β-GP组相比,β-GP+g Ad 1μg/ml组、β-GP+g Ad 2μg/ml组钙含量与ALP活性显著降低,差异具有统计学意义(分别P<0.05)。(2)control组及g Ad组偶见细胞凋亡,β-GP组TUNEL阳性细胞明显增多、caspase3活性显著升高;与β-GP组相比,β-GP+g Ad1μg/ml组、β-GP+g Ad 2μg/ml组TUNEL阳性细胞明显降低,caspase3活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与control组相比,β-GP组和β-GP+g Ad 0.5μg/ml组GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表达显著增加,OPGm RNA和蛋白表达显著降低(分别P<0.01);与β-GP组相比,β-GP+g Ad 1μg/ml组、β-GP+g Ad2μg/ml组GRP78、CHOP、caspase12及Runx2m RNA和蛋白表达显著降低,OPGm RNA和蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。提示外源性给予g Ad可以减轻平滑肌细胞钙化。其中以2μg/ml的浓度为佳,说明g Ad的血管保护作用具有浓度依赖性。结论:g Ad可通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡而减轻平滑肌细胞钙化,且这种作用具有浓度依赖性。