粳稻云引是福建省农业科学院水稻国家工程实验室从云南省农业科学院引进的常规粳稻品种,通过对其进行多菌株混合田间注射接菌和单一菌株离体鉴定以及室内喷雾接菌进行稻瘟病抗性鉴定,结果发现云引对所使用的60个稻瘟病菌株中的58个菌株表现抗性。结合图位克隆技术从云引中克隆了稻瘟病抗性基因Piy43(t),基因精细定位结果表明,该基因和已克隆的稻瘟病抗性基因Pib位于同一位点,而且该位点还存在一个假基因,这个假基因与Pib基因序列的同源性达96%。为了进一步研究稻瘟病抗性基因Piy43(t)和Pib之间的关系,本实验开展了以下研究,获得如下结果:1.使用稻瘟病菌菌株“川43”对粳稻云引和Pib单基因系鉴别品种进行接种鉴定,结果表明,喷雾接种5d后,云引叶片没有病斑出现,其他品种的叶片均出现了大小不一的病斑。Pib单基因系鉴别品种在接菌后表现为中抗,而云引则表现为抗病。2.qRT-PCR分析结果结果表明:当云引和Pib单基因鉴别品种接种稻瘟病菌12h时,Piy43 的表达量最低,24h开始上升,24-48h之间呈下调趋势;Pib单基因鉴别品种中Pib的表达量在72h达到一定的高度,之后继续下降,云引中Piy43(t)在72h至96h之间继续呈上调趋势。在Pib单基因鉴别品种中Pib表达量波动较大,而在云引中Piy43(t)表达量相对稳定。3.根据Pib基因序列设计引物,分别在云引和Pib单基因鉴别品种中克隆相应的基因,序列比对结果表明,云引中的Pib(Piy43(t))与Pib单基因鉴别品种中的Pib基因存在7处核苷酸序列;氨基酸序列比对结果表明,云引中的Pib(Piy43(t))与Pib单基因鉴别品种中的Pib基因有3处氨基酸序列的差异。4.在云引和Pib单基因鉴别品种中克隆了假基因Pib2基因,序列比对结果表明,云引和Pib单基因鉴别品种中的假基因Pib2存在4处核苷酸的差异,其中在启动子区域的差异主要是碱基缺失和插入。5.分别构建了 Piy43(t)、Pib2的过表达载体,以及二者融合表达载体;构建了Piy43(t)的亚细胞定位载体和RNAi干扰载体;分别构建了Piy43(t)、Pib2的CRISPR-Cas9基因编辑载体以及同时敲除两个基因的CRISPR-Cas9基因敲除载体;构建了Pib 2的启动子驱动GUS基因的表达载体。分别通过农杆菌介导转化转入云引和日本晴中,已获得部分载体的转基因植株。