一、临床研究目的慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是严重危害人类健康的疾病之一,目前全球发病率约为10-15%,国内发病率约为10.8%,并呈上升趋势,因此如何防治CKD已成为全球医疗系统需要面临的巨大挑战[1]。“升清降浊胶囊”是我院的院内制剂之一,主治慢性肾功能不全,功效为益气升清,通腑降浊。本研究采用升清降浊胶囊治疗CKD3-5期非透析患者,通过观察升清降浊胶囊对CKD 3-5期患者的肾脏代谢功能、营养状态的改善及中医证候疗效的区别,以验证升清降浊胶囊的临床疗效。方法采用前瞻性研究的方法,纳入慢性肾脏病3-5期患者（非透析）84例,数字表法随机分为治疗组和对照组,每组42例。两组在CKD具体分期分布、性别、年龄等基线上没有统计学差异。对照组给予常规对症治疗,治疗组在对照组基础上给予升清降浊胶囊治疗,2组均连续治疗3个月。分析两组患者治疗前后的中医证候积分及实验室指标（肌酐（Creatinine,Cr）、血尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、血尿酸（Uric acid,UA）、估算肾小球滤过率（Estimated Glomerular Filtration Rate,e GFR）、白蛋白（Albumin,ALB）、血红蛋白（Hemoglobin,HGB））等。结果1.中医证候疗效:两组治疗前,中医证候积分组间无统计学差异。治疗后,治疗组中医证候积分较治疗前均有明显改善,差异有统计学意义（P<0.05）,而对照组较同组治疗前改善不明显;组间比较,两组治疗后中医症候疗效差异有统计学意义（P<0.05）。2.实验室指标:同组治疗前后对比,治疗组和对照组Cr、BUN、UA和e GFR均较同组治疗前下降,有统计学意义（P<0.05）。组间比较采用独立样本T检验,治疗后治疗组Cr、BUN、UA和e GFR与对照组治疗后比较,差异有统计学意义（P<0.05）。同组治疗前后对比,采用两组配对样本T检验,治疗组和对照组ALB和HGB均较同组治疗前下降,有统计学意义（P<0.05）。组间比较采用独立样本T检验,治疗后治疗组ALB和HGB与对照组治疗后比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论升清降浊胶囊可以显著改善CKD 3-5期非透析患者的肾功能,能够降低其Cr、BUN、UA,使e GFR升高;可以明显改善其营养状况和中医临床症状,降低中医症候积分,显著提高中医证候疗效,从而达到保护残余肾功能,延缓CKD进展的作用。二、实验研究目的CKD发病机制复杂,包括免疫炎症反应、氧化应激、脂代谢紊乱等,其具体机制尚不清楚。肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis,RIF）是各种CKD进展至终末期肾病的共同病理特征,如何减轻RIF对于延缓CKD进程具有重要意义[1]。本研究首先通过网络药理学筛选出升清降浊胶囊治疗CKD的有效单体成分槲皮素,可与4,5-二磷酸化磷脂酰肌醇-3位磷酸激酶（Phosphatidylinositol trikinase,PI3K）结合后调控下游蛋白激酶B（Serine/threonine kinase,Akt）信号通路;进一步通过腺嘌呤诱导CKD模型小鼠,证实升清降浊胶囊具有保护CKD小鼠肾功能,抗RIF的作用;最后,通过检测PI3K/Akt信号通路中的各蛋白表达情况,论证升清降浊胶囊有效单体槲皮素,可通过抑制PI3K/Akt信号通路减轻RIF。方法1.使用网络药理学方法,通过TCMSP数据库检索升清降浊胶囊主要活性成分,将其对应的成分靶点与Genecard数据库下载的CKD疾病靶点相交,构建中药-成分-靶点网络,绘制出维恩图;运用STRING软件构建蛋白质互作用（PPI）网络,筛选出PIK3R1作为候选基因。使用Cytoscape Clue GO软件对91个靶点进行了GO分析和KEGG通路分析,并对富集结果进行了可视化处理,筛选出有效单体成分、信号通路和作用靶点。2.通过腺嘌呤溶液200mg/（kg·d）灌胃建立CKD大鼠模型。将50只雄性SD大鼠随机分为正常组（n=10）,模型组（n=10）,升清降浊胶囊低剂量治疗组（n=10）,升清降浊胶囊中剂量治疗组（n=10）,升清降浊胶囊高剂量治疗组（n=10）,后四组分别给予空胶囊、升清降浊胶囊0.25g/d、升清降浊胶囊0.5g/d、升清降浊胶囊1g/d灌胃,共治疗8周,测量5组大鼠体重,采集大鼠静脉血检测Cr、BUN。HE染色和MASSON染色观察肾脏病理改变,Western blot检测P13K、AKT、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、SGK-1、NF-κB的表达。3.将50只CKD模型鼠随机分为正常组（n=10）、模型组（n=10）、槲皮素低剂量组（n=10）、槲皮素中剂量组（n=10）、槲皮素高剂量组（n=10）,模型组每天以生理盐水灌胃,三个剂量组每天分别以0.75、1.5和3g/（kg·d）剂量的槲皮素溶液灌胃,持续8周。检测5组大鼠Cr、BUN、UA水平。HE染色观察肾脏病理改变,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫荧光染色检测NLRP3、caspase1、AQP1、AQP2的表达,Western blot检测NLRP3、caspase1、p-PI3k、PI3k、p-Akt、Akt、AQP1、AQP2的表达,ELISA检测大鼠肾组织α-SMA、COL IV蛋白表达,q PCR检测大鼠肾组织α-SMA、COL IV m RNA表达。结果1.通过网络药理学获取升清降浊胶囊主要活性成分44个,作用靶点298个,共梳理出CKD疾病靶点1270个,两者交叉获得91个重叠基因;GO功能富集分析和KEGG通路分析获取GO条目35个,信号通路49条,其中PIK3R1位于边缘最多的中心。升清降浊胶囊的四种主要成分虎杖、土茯苓、槐花、黄芪均含有槲皮素,槲皮素可能与多个靶基因相互作用。2.模型组和治疗组大鼠体重均低于正常组,但治疗组体重高于模型组。与正常组相比,模型组的Cr、BUN、UA水平显著升高（P<0.01）。与模型组相比,3个治疗组给药后Cr、BUN和UA水平显著降低（P<0.01）,其中高剂量组疗效最佳。HE染色中小管间质病理改变最轻微、最接近正常组的是高剂量治疗组。MASSON染色中,模型组大鼠肾脏可见肾小球的数量明显减少伴严重萎缩,并可见间质胶原纤维呈环状沉积在基底膜区和上皮组织附近。高剂量治疗组中,肾小管间质胶原沉积较模型组明显减轻,沉积区域变小。Westen Blot结果显示,3组治疗组的P13K、AKT、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、SGK-1、NF-κB等蛋白表达较模型组均有降低。其中,PI3K、Akt、SGK-1的蛋白表达降低在高剂量治疗组最显著,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、NF-κB的蛋白表达降低在中剂量治疗组最显著。3.与模型组相比,槲皮素中、高剂量组大鼠给药后Cr、BUN、UA水平显著降低（P<0.01）。HE染色中,模型组大鼠在皮质区及外髓质区出现典型肾小管坏死,而3个槲皮素治疗组中,肾小管坏死程度较模型组轻微,肾间质仅发生轻度水肿,而炎症细胞浸润不明显。流式细胞术显示,模型组有大量细胞凋亡,凋亡率明显高于正常组。而槲皮素不同剂量治疗组细胞凋亡率明显少于模型组,其中高剂量组效果最明显。免疫荧光检测提示,模型组的肾组织中NLRP3和caspase1的平均荧光强度比明显高于正常组。与模型组相比,槲皮素治疗组平均荧光强度比显著降低。模型组AQP1和AQP2的平均荧光强度比明显低于正常组,而槲皮素组AQP1和AQP2的平均荧光强度比增加。Western blot结果与免疫荧光结果具有一致的趋势。结论1.升清降浊胶囊能显著改善大鼠CKD肾功能,其作用机制可能与减轻RIF的相关。2.使用网络药理学方法,对升清降浊胶囊进行有效单体、信号通路及作用靶点分析,发现其有效单体成分之一为槲皮素,根据文献查阅和统计分析,最后选择研究对象为PI3K/Akt信号通路。3.进一步研究发现槲皮素可以与PI3K结合,抑制PI3k/Akt通路来减少CKD大鼠的肾纤维化和细胞凋亡,并通过调节AQP1和AQP2有效减轻肾小管间质纤维化,减轻尿毒症症状。综合我们得出结论:升清降浊胶囊对CKD进程中的肾小管间质纤维化具有抑制作用,其具体分子机制可能是通过其有效成分槲皮素与PI3K结合,抑制PI3K/Akt信号通路的活化发挥作用。另一方面,抑制PI3K/Akt信号通路,还可以调节AQP1和AQP2水通道蛋白,有效减少CKD尿毒症毒素的积聚和水钠潴留,减轻CKD症状。