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目的：探讨泛素分子在非小细胞肺癌中的表达,转染抑制泛素基因表达的shRNA-UBB、UBC质粒联合X射线对人非小细胞肺癌A549和H1299细胞生长和放射敏感性的影响及机制研究,在动物体内验证下调泛素表达的致放射增敏作用。 方法： （一）通过免疫组化法检测泛素在肺癌及癌旁组织中的差异表达,并通过体内、外实验研究下调泛素对非小细胞肺癌的放射敏感性的影响及其机制: （二)体外实验: 1、设计沉默泛素基因表达的shRNA-UBB和shRNA-UBC,用RT-PCR及Western blot法验证shRNA的沉默效果; 2、MTT法及克隆形成实验检测转染抑制泛素基因表达的shRNA-UBB, shRNA-UBC, shRNA-UBB/UBC(联合转染shRNA-UBB和shRNA-UBC)对肺癌A549和H1299细胞的增殖及放射敏感性的影响; 3、流式细胞计数法测定下调泛素表达对人肺癌H1299细胞的凋亡和周期分布的影响; 4、Western-blot法测定上述干预处理后细胞凋亡、周期、DNA损伤相关蛋白表达水平的改变; 5、细胞免疫荧光法检测辐射诱导的细胞γH2AX清除能力的变化。 （三)体内试验: 1、裸鼠皮下建立人非小细胞肺癌移植瘤模型,按实验要求分组。测量肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线,计算各组的肿瘤生长抑制率; 2、检测增殖指标Ki67表达水平的变化。 结果：泛素在非小细胞肺癌中的表达明显高于癌旁组织,成功设计并转染shRNA下调泛素的表达。 体外实验结果: 1、RT-PCR结果显示shRNA-UBB-4(shRNA-B4)及shRNA-UBC-2(shRNA-C2)的抑制泛素基因表达的效果比较明显,蛋白水平抑制率达76％,因此选择这两种shRNA质粒进行后续功能实验的研究; 2、分别在A549和H1299细胞中转染shRNA-UBB, shRNA-UBC及shRNA-UBB/UBC,MTT检测结果为shRNA-UBB/UBC能明显抑制H1299细胞的增殖(p<0.05),而分别转染shRNA-UBB,shRNA-UBC时其抑制作用不及联合转染组明显;在A549细胞中, shRNA-UBB/UBC能抑制其增殖(p<0.05),但其细胞生长抑制率低于H1299(67.3％VS.32.8％,24h,32.9％VS.16.5％,48h); 3、克隆形成实验检测细胞放射敏感性结果提示: H1299细胞单纯照射组和照射联合shRNA-UBB/UBC组的平均致死剂量(D0)分别为1.40和0.97Gy,准域剂量Dq分别为1.99和1.42,shRNA-UBB/UBC对H1299细胞的放射增敏比(SER)为1.44,而对A549细胞的放射增敏比(SER)为1.05; 4、进一步研究下调泛素表达联合X射线对H1299细胞凋亡的影响,结果表明6Gy X射线联合下调泛素表达(shRNA-UBB/UBC)组细胞凋亡率明显增加,细胞凋亡率由8.79％增至30.44％(P<0.05)。基因组DNA凝胶电泳分析,泛素下调(shRNA-UBB/UBC)加照射组与单纯X射线照射组比较,基因组DNA中180 bp左右凋亡片段明显增多,与流式细胞仪检测结果一致,下调泛素表达促进辐射诱导的细胞凋亡; 5、下调泛素表达处理后,6Gy X射线诱导的H1299细胞γH2AX清除能力下降; 6、联合转染shRNA-UBB/UBC可显著增加H1299细胞的G1期阻滞,联合X射线作用下,在相同照射剂量条件下,联合转染shRNA-UBB/UBC对H1299细胞的周期分布没有影响; 7、Western-blot结果显示,转染shRNA-UBB/UBC联合X射线照射后能明显降低H1299细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2,p-AKT,cyclinD1及NF-κB的表达水平。NF-κB的抑制蛋白IκB磷酸化水平降低(IκB蛋白磷酸化后经泛素蛋白酶系统降解,而后NF-κB活化),从而转位入胞核内的NF-κB蛋白水平降低。 体内实验结果: 1、成功构建裸鼠的H1299细胞移植瘤模型,实验过程中,裸鼠的体重无明显变化; 2、shRNA-UBB/UBC+IR组的H1299细胞裸鼠移植瘤的体积与单纯照射组相比显著减小,差异具有统计学意义(P<0.05);与单纯照射组比较,shRNA-UBB+IR组、shRNA-UBC+IR组、shRNA-UBB/UBC+IR组的肿瘤生长抑制率分别:(51.55±10.85)％,(70.26±5.66)％,(74.61±7.59)％,(79.31±6.48)％。 结论：泛素在非小细胞肺癌中高表达;转染shRNA-UBB, shRNA-UBC下调人非小细胞肺癌A549和H1299细胞后出现明显的细胞增殖抑制作用,其对H1299细胞的增殖抑制作用较A549细胞显著;下调泛素表达能明显增加人非小细胞肺癌H1299细胞的放射敏感性(SER=1.44),而在A549细胞中不存在该效应(SER=1.05);下调泛素表达可显著增加X线诱导的人非小细胞肺癌H1299细胞的凋亡作用并降低其DNA损伤修复功能;下调泛素表达可显著增加H1299细胞的G1期阻滞,联合X射线作用下,在相同照射剂量条件下,体内泛素水平对H1299细胞的周期分布没有影响;下调泛素表达联合X射线照射通过降低H1299细胞的p-AKT,cyclinD1及NF-κB的表达,抑制NF-κB活化并入核在下调泛素表达所致的对H1299细胞放射增敏过程中发挥着重要作用;下调泛素表达联合X射线作用在不影响裸鼠体重的情况下,对人非小细胞肺癌 H1299细胞的裸鼠移植瘤的生长呈现显著的抑制作用。