【研究背景和目的】睡眠剥夺（sleep deprivation,SD）会导致认知缺陷,表现为注意力、决策、学习和各种类型的记忆受损。SD与众多神经和精神疾病密切相关,临床发病率高,严重危害公众健康。因此,探究SD如何损害认知功能,寻找预防或治疗认知障碍的药物靶点具有十分重要的科学价值。研究表明,SD降低学习记忆中枢海马神经可塑性相关蛋白的合成、损害海马神经发生,最终影响海马依赖的学习记忆功能。此外,海马中富含大量的炎性因子受体,容易受到促炎因子的影响,而SD能够诱导神经炎症和氧化应激,进一步损害海马功能。肝X受体（liver X receptors,LXRs）是一种核受体,包括LXRα和LXRβ两个亚型,在调节脂质代谢和抑制炎症中都发挥了重要的作用。LXRα主要分布于负责脂类代谢的外周脏器,LXRβ则高表达于中枢神经系统（central nervous system,CNS）,特别是与认知功能相关的海马脑区。研究发现,GW3965（GW）通过激活LXRs抑制脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的炎症反应中促炎因子的释放,改善阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）所致的认知损伤。然而,LXRs是否参与SD诱导的认知功能障碍及其激动剂GW是否能改善且其中的机制尚不清楚。以往文献证实,敲除LXRβ后脑内出现大量活化的小胶质细胞,提示LXRβ功能缺失会诱发小胶质细胞的激活。小胶质细胞是CNS中的免疫细胞,可在SD后被激活,诱导促炎因子的持续产生,导致神经元损伤,诱发认知障碍。高迁移率族蛋白1（high mobility group box1,HMGB1）/Toll样受体4（toll-like receptor4,TLR4）/核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）通路是神经炎症重要的炎性信号通路,该通路的激活与活化的小胶质细胞息息相关。HMGB1是典型的病理损伤相关因子,在不可预知的应激刺激下,HMGB1由活化的小胶质细胞分泌并参与神经炎症。而TLR4是HMGB1的特异性受体,高表达于小胶质细胞。研究证实,在激活的小胶质细胞中,HMGB1通过与TLR4结合,导致NF-κB核易位增加,随后诱导肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）等促炎因子的释放,诱发海马神经炎症,损害学习记忆功能。因此,通过抑制小胶质细胞过度活化,抑制HMGB1信号通路,可能纠正由神经炎症介导的海马神经元损伤,改善认知功能。本课题通过动物实验、离体实验探讨激活海马LXRβ是否可以抑制小胶质细胞的活化,进而抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路介导的神经炎症,改善SD诱导的认知障碍。本课题旨在揭示激活海马LXRβ改善SD诱导的认知障碍的作用机制,可能为改善认知障碍提供新的治疗靶点。【研究方法】1探究LXRs是否参与SD诱导的认知障碍1.1 SD对小鼠海马区LXRs表达的影响首先,采用小平台水环境法每日剥夺小鼠20 h睡眠,连续28 d,建立SD模型。置于水箱上的摄像头,可实时观察实验小鼠的觉醒状态,以评判小鼠睡眠是否被真正剥夺。对照小鼠置于同样环境中,则可自由睡眠。实验结束,收集小鼠海马脑组织样本,采用蛋白免疫印迹（western blot,WB）检测SD模型小鼠海马中LXRα和LXRβ表达的变化。1.2 LXRs激动剂GW对SD小鼠认知功能的影响实验小鼠剥夺睡眠第15天给予LXRs激动剂GW（10 mg/kg）腹腔注射,持续14 d,同体积的生理盐水方法同上,用作对照。Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）检测小鼠学习和记忆能力。新物体识别（novel object recognition,NOR）检测小鼠对新奇事物的识别、记忆能力。通过以上两种行为学检测,评价GW能否改善SD小鼠认知功能。1.3腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）下调海马区LXRs的表达对小鼠认知功能的影响首先,设计并包装生产获得LXRα和LXRβ的腺相关病毒干扰表达载体（short hairpin RNA for LXRα,sh LXRα;short hairpin RNA for LXRβ,sh LXRβ）和阴性对照（short hairpin RNA for negative control,sh NC）。小鼠双侧海马区立体定向注射sh LXRα和/或sh LXRβ,以降低LXRα和/或LXRβ的表达;病毒感染21 d后,免疫荧光（immunofluorescence,IF）观察立体定向注射位置是否正确及海马区细胞的感染率;WB检测病毒感染的效率;行为学实验评价小鼠认知功能的改变。1.4确定参与GW改善认知功能的LXRs受体亚型目前尚无LXRs两种亚型的特异性激动剂,实验中采用的GW可同时激动LXRα和LXRβ。为了确定GW改善认知功能作用的LXRs受体途径,我们采用小鼠双侧海马区立体定向注射sh LXRα和/或sh LXRβ以降低LXRα和/或LXRβ的表达,继之建立SD模型,GW治疗方法同上。行为学检测下调LXRα和/或LXRβ表达水平是否会影响GW改善认知的作用,从而初步确定介导GW改善认知功能的LXRs受体亚型。2探究激活LXRs是否通过抑制神经炎症改善认知障碍2.1激活LXRs对SD小鼠海马区小胶质细胞状态和数量的影响采用IF观察LXRβ是否表达于小胶质细胞。SD小鼠给予或不给予GW治疗后,采用IF和WB检测海马区小胶质细胞形态、数量以及小胶质细胞标志物Iba-1表达水平的变化。2.2激活LXRs对SD小鼠海马区HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的影响为了明确海马区HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路是否参与SD,采用WB法检测不同组小鼠海马区该通路信号蛋白及促炎因子TNF-α和IL-1β表达的变化,进一步观察给予或不给予GW对该信号通路的影响。3激活LXRs抑制神经炎症改善认知的机制研究3.1探究GW通过LXRβ抑制炎症刺激下小胶质细胞HMGB1通路的激活体外培养N9小胶质细胞,建立LPS/ATP诱导的炎症模型,WB检测小胶质细胞活化的标志物CD68和Iba-1表达的变化;进一步观察GW（0、1、10、100μM）预处理对CD68和Iba-1表达水平的影响;继而以sh LXRβ降低LXRβ的表达,WB法检测sh LXRβ对HMGB1/TLR4/NF-κB p65及TNF-α、IL-1β表达的影响,同时采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞上清液中HMGB1、TNF-α和IL-1β表达的变化。3.2探究GW通过抑制小胶质细胞HMGB1通路发挥抑制炎症的作用N9小胶质细胞炎症模型同上,给予HMGB1抑制剂甘草酸（glycyrrhizin,GLY）和/或GW预处理,WB法检测NF-κB p65及TNF-α、IL-1β表达变化,ELISA法检测细胞上清液中TNF-α和IL-1β的表达水平。3.3探究GW通过抑制HMGB1炎性信号通路发挥改善认知的作用SD模型建立方法同前,给予SD小鼠GW（10 mg/kg）和/或GLY（20 mg/kg）治疗14 d,行为学检测小鼠认知功能的改变,评价抑制HMGB1对GW改善认知功能的影响。【研究结果】1探究LXRs是否参与SD诱导的认知障碍1.1 SD对小鼠海马区LXRs表达的影响视频结果显示,SD造模期间实验小鼠均被迫保持清醒状态,表明该造模方法能够有效剥夺小鼠睡眠。WB结果显示,与Ctrl组相比,SD小鼠海马区LXRβ表达显著降低,LXRα表达无明显变化。1.2 LXRs激动剂GW对SD小鼠认知功能的影响行为学结果显示,与Ctrl组相比,SD后小鼠认知功能明显受损。给予GW腹腔注射治疗,与SD组相比,SD+GW组小鼠认知功能显著提高。1.3 AAV下调海马区LXRs的表达对小鼠认知功能的影响小鼠海马区立体定向注射shLXRα和/或shLXRβ后,IF结果显示,AAV可成功感染小鼠海马区细胞;WB结果显示,与阴性对照组sh NC相比,病毒感染后相对应的LXRα和/或LXRβ的表达降低。行为学结果显示,与sh NC组相比,sh LXRα+β和sh LXRβ组小鼠均出现认知功能障碍,而sh LXRα组小鼠认知功能无明显改变。1.4确定参与GW改善认知功能的LXRs受体亚型MWM结果显示,给予GW治疗,与sh NC+SD+GW组相比,sh LXRα+SD+GW组小鼠行为学无明显变化,而sh LXRβ+SD+GW组或sh LXRα+β+SD+GW组小鼠则出现认知功能下降。2探究激活LXRs是否通过抑制神经炎症改善认知障碍2.1激活LXRs对SD小鼠海马区小胶质细胞状态和数量的影响IF检测发现小胶质细胞表达LXRβ。WB/IF检测发现,与Ctrl组相比,SD组小鼠海马区小胶质细胞标志物Iba-1的表达上升,且静息态小胶质细胞减少,活化态小胶质细胞增多。给予GW治疗后,SD组Iba-1的表达水平明显降低且活化态小胶质细胞数量减少。2.2激活LXRs对SD小鼠海马区HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的影响WB检测发现,与Ctrl组相比,SD组小鼠海马区HMGB1、TLR4、细胞核NF-κB p65及促炎因子TNF-α、IL-1β表达水平上升。与SD组相比,给予GW治疗后,海马区HMGB1、TLR4、细胞核NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达水平下降。3激活LXRs抑制神经炎症改善认知的机制研究3.1探究GW通过LXRβ抑制炎症刺激下小胶质细胞HMGB1通路的激活WB检测发现,与Ctrl组相比,LPS/ATP处理后CD68和Iba-1的表达均升高。使用不同浓度GW预处理后给予LPS/ATP刺激,则GW浓度依赖性地降低LPS/ATP诱导的CD68和Iba-1的高表达,其中10μM GW预处理更能显著性降低CD68和Iba-1的表达水平。WB检测发现,与阴性对照组sh NC相比,sh LXRβ可显著降低小胶质细胞LXRβ的表达水平。WB检测发现,与sh NC+LPS/ATP+GW组相比,sh LXRβ+LPS/ATP+GW组HMGB1、TLR4、细胞核NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达水平升高。ELISA检测细胞上清液中HMGB1、TNF-α和IL-1β的表达变化趋势相似。3.2探究GW通过抑制小胶质细胞HMGB1通路发挥抑制炎症的作用WB检测发现,与LPS/ATP组相比,LPS/ATP+GLY组细胞核中的NF-κB p65、TNF-α和IL-1β表达水平降低;与LPS/ATP+GW组相比,LPS/ATP+GW+GLY组细胞核NF-κB p65表达降低。ELISA检测发现,GLY降低LPS/ATP刺激后细胞上清液中TNF-α和IL-1β的表达水平。与LPS/ATP+GW组相比,LPS/ATP+GW+GLY组细胞上清液中TNF-α和IL-1β表达水平更低。3.3探究GW通过抑制HMGB1炎性信号通路发挥改善认知的作用行为学检测发现,GLY治疗后SD小鼠认知功能得到改善。此外,SD+GW+GLY组小鼠认知功能强于SD+GW组或SD+GLY组小鼠。【研究结论】本课题结果显示,SD可诱导小鼠认知障碍,并导致海马LXRβ表达减少,使用sh LXRβ下调海马LXRβ的表达后,小鼠亦出现认知障碍,提示LXRβ表达降低可能是认知障碍发生的重要机制。SD可激活海马小胶质细胞和HMGB1/TLR4/NF-κB p65炎性通路,诱导促炎因子高表达。GW抑制SD小鼠海马小胶质细胞的活化,抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65炎性通路,最终降低促炎因子的表达,改善SD小鼠认知功能。此外,GW抑制神经炎症改善认知的作用是通过激活LXRβ而非LXRα实现的,抑制HMGB1则可增强GW对活化小胶质细胞的抑炎作用,同时可促进GW改善SD小鼠认知的功能。以上结果表明,GW通过激活LXRβ抑制小胶质细胞和HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路,降低促炎因子的表达水平,最终改善SD小鼠的认知功能障碍。本课题探究了激活LXRβ通过抑制神经炎症发挥治疗SD所致认知障碍的机制,可能为发现改善认知障碍新的治疗靶点提供理论依据。