土霉素是常用的一种广谱四环素类抗生素,被广泛用于预防和治疗畜禽疾病及促生长作用,但在饲喂后大部分土霉素以原形或代谢产物的形式通过粪尿排放进入到环境中,给环境生态系统带来潜在的影响和危害。而含有抗生素残留的粪便长期施加于土壤中可能对反硝化作用(Denitrification)产生影响。国内外对这方面的相关报道仍然较少,因此评估土霉素残留对土壤环境中微生物群落尤其是反硝化菌群的影响尤为必要。本试验通过构建室内施粪菜地土壤的土霉素胁迫模型,设置空白组(0μg/kg)、低浓度组(20μg/kg)、中浓度组(200μg/kg)和高浓度组(2000μg/kg),分别在1、7、14、30、60 d采集土壤样品,采用荧光定量PCR检测、末端限制性片段长度多态性分析以及高通量测序方法等研究了不同浓度土霉素对土壤微生物群落尤其是反硝化细菌的影响,探究土壤中主要反硝化功能基因丰度及多样性变化、土壤菌群结构和功能多样性变化。结果显示,低、中浓度土霉素对携带nirS、nirK基因的反硝化菌群有促进作用,而高浓度则表现为抑制。随着胁迫时间的延长,nirS、nirK、narG基因丰度均呈缓慢下降,而携带nosZ基因的菌群对土霉素的胁迫反应较迟钝。对两个具有代表性的反硝化功能基因nirS、nosZ进行末端限制性片段长度多态性分析,发现土霉素对土壤中携带有nirS、nosZ基因的优势片段均无明显影响,而随着时间的延长,携带nirS基因的反硝化优势片段在第30~60 d之间发生了变化,说明不同浓度土霉素可以影响反硝化菌群丰度,但对土壤优势菌群无明显影响,土壤中其它因素可能对优势菌群的影响更大。对第1、30 d各浓度土霉素胁迫下的土壤样品进行高通量测序,菌群注释结果显示:土壤中门水平优势细菌有变形杆菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)以及拟杆菌门(Bacteroidetes)等。其中变形杆菌门细菌占绝对优势且在第30 d的相对丰度出现下降,而放线菌门细菌却呈相反变化。值得注意的是,厚壁菌门细菌在第30 d出现骤然下降,转而变成拟杆菌门细菌为优势菌门。属水平上,第1 d的优势菌属为鲍曼不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas),而在第30 d时,优势菌属变为黄单胞杆菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。功能注释结果表明:第1 d的“碳水化合物”代谢能力比第30 d的强,而土霉素各浓度对其影响并不大。此外,第30 d时反硝化代谢功能比第1 d强,且添加土霉素各组的硝酸还原酶相对丰度比空白组土壤高,表明土霉素能够促进硝酸还原酶的表达。此外,亚硝酸还原酶、一氧化二氮还原酶的相对丰度在第30 d均有所上升,表明反硝化酶的表达可能受多种因素的共同影响。以上结果表明:长期施加含有低、中浓度土霉素的畜禽粪便对土壤中氮肥会造成流失,不利于农作物的生长。而高浓度土霉素则会直接抑制土壤菌群的生长,对土壤微生物造成破坏。