论文部分内容阅读
目的：观察稳定转染缺氧诱导因子-1α miRNA（microRNAs）（HIF-1α miRNA）对人肺腺癌细胞株A549增殖、凋亡、迁移及其对survivin转录、翻译的影响，探讨HIF-1α在非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）中对survivin的转录调控。方法：（1）设计合成针对HIF-1α不同位点的4组pre-miRNA干扰序列（分别是1170~1191、1207~1228、647~668、210~231），构建质粒表达载体（含有pcDNATM6.2-GW/EmGFP的miRNA载体1、2、3和4）。（2）应用脂质体分别将HIF-1α miRNA4组质粒和neg、β-actin miRNA质粒转染A549细胞，blasticidin（杀稻瘟菌素）筛选阳性克隆扩大培养，采用RT-PCR和Western blot法筛选出对A549细胞干扰效果最佳的HIF-1α miRNA干扰载体。（3）采用RT-PCR和Westernblot法分别在常氧、缺氧条件下检测转染后HIF-1α、survivin在mRNA和蛋白水平的变化。（4）稳定转染后细胞，放置在常氧和缺氧环境下，不同时间段采用CCK8法、流式细胞术和Transwell迁移实验检测细胞的增殖、凋亡及迁移力。结果：（1）测序鉴定构建的干扰质粒成功，并筛出干扰效果最佳miRNA载体（647~668位点）。（2）HIF-1α miRNA转染A549细胞后常氧条件下能够有效地抑制靶基因mRNA和蛋白表达，同时发现survivin mRNA及蛋白表达也明显受到抑制（P <0.01），缺氧条件下该效应更为明显；（3）常氧条件下，转染miRNA后A549细胞增殖、凋亡无明显变化（P>0.05），但迁移力减弱（P <0.05）；缺氧条件下，转染miRNA后A549细胞生长速度减慢（P <0.01），凋亡率增加（P <0.01），细胞体外的迁移力减弱（P <0.01）。结论：miRNA沉默A549细胞HIF-1α表达后，可有效下调survivin基因表达，并在常氧条件下抑制细胞迁移；缺氧条件下促进细胞凋亡，抑制细胞增殖和迁移。