胆囊癌细胞耐药，具有干细胞特性的胆囊癌侧群（side population，SP)细胞耐药性更强，是影响化疗疗效的主要原因之一。我们前期研究发现升高胆囊癌细胞内活性氧(reactive oxygen species，R0S)水平能下调耐药相关蛋白、提高细胞对顺铀（CDDP)的敏感性，但R0S水平的升高如何促进耐药相关蛋白下调尚不清楚。研究提示，髓细胞白血病-1(myeloid cell leukemia1，Mcl-1)是抗凋亡蛋白，可导致细胞化疗耐药，其稳定性受到氧化还原修饰一谷胱甘肽化修饰的调控。这提示我们升高R0S可能通过谷胱甘肽化修饰途径下调Mcl-1蛋白，逆转胆囊癌细胞耐药。但在胆囊癌细胞、尤其是SP细胞中，Mcl-1和CDDP耐药的关系，以及谷胱甘肽化修饰对Mcl-1的影响仍不清楚。本研究拟阐明Mcl-1在胆囊癌细胞、S P细胞CDDP耐药中的作用和谷胱甘肽化修饰调控Mcl-1蛋白稳定性的机制，并证明通过异硫氰酸苯乙酯（PEITC)增加Mcl-1的谷胱甘肽化修饰可加强胆囊癌细胞CDDP敏感性。此外，Mcl-1的转录因子信号传导与转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription3，STAT3)活性被报道也受到谷胱甘肽化修饰的调控，我们拟证明通过调控STAT3的谷胱甘肽化修饰可抑制Mcl-1蛋白生成、改善胆囊癌细胞⑶DP耐药特性。　　第一部分：髄细胞白血病-1在胆囊癌细胞对顺拍耐药中的作用研究　　目的：研究胆囊癌细胞、胆囊癌S P细胞对⑶DP耐药中Mcl-1蛋白的作用。　　方法：检测⑶DP诱导下胆囊癌GBC-SD细胞Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-l蛋白表达量变化。检测Mcl-1蛋白在SP细胞和非SP细胞中的表达差异。检测Mcl-1蛋白在人胆囊癌和慢性炎症胆囊组织中的表达差异。用siRNA下调Mcl-1蛋白表达，检测沉默Mcl-1蛋白对⑶DP诱导细胞凋亡的影响。　　结果：　　1.CDDP特异性诱导胆囊癌细胞Mcl-1蛋白表达增加，并不增加Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达。　　2.胆囊癌SP细胞中Mcl-1蛋白表达量明显高于非S P细胞。　　3.人胆囊癌组织Mcl-1蛋白表达率(71.4％)明显高于慢性炎症胆囊组织(26.7%)。　　4.沉默Mcl-1蛋白能显著增加CDDP诱导的细胞凋亡。　　结论：抗凋亡蛋白Mcl-1是胆囊癌细胞对CDDP耐药、胆囊癌S P细胞更耐药的原因之一。　　第二部分异硫氰酸苯乙酯增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究　　目的：在普通肿瘤细胞系、SP细胞、裸鼠移植瘤三个层面观察Mcl-1靶向药物PEITC和CDDP治疗胆囊癌细胞的协同效应，并探讨机制。　　方法：分对照、PEITC, CDDP、PEHC/⑶DP联合处理4组，处理胆囊癌GBC-SD细胞、胆管癌RBE细胞、胆囊癌S P细胞，MTT检测细胞活力，流式细胞术定量细胞凋亡率，试剂盒检测细胞caspase3活性，western-blot检测细胞Mcl-1蛋白表达量。　　用胆囊癌GBC-SD细胞接种裸鼠28只建立荷瘤动物模型，成瘤达50mm3后随机分为对照、PEHC、CDDP、PEHC/⑶DP联合处理4组，每组7只。腹腔给药10天后，观察裸鼠的体重以及移植瘤的重量和体积变化，western-blot检测移植瘤Mcl-1蛋白表达量。　　结果：　　1.PEITC能增加⑶D P对胆囊癌细胞、胆管癌细胞、胆囊癌SP细胞的杀伤作用。　　2.PEHC能够促进⑶DP抑制胆囊癌细胞移植瘤的生长，无明显毒副作用。　　3.PEHC能下调胆囊癌细胞、胆囊癌SP细胞、移植瘤中Mcl-1蛋白，PEHC/⑶DP联合治疗组Mcl-1蛋白表达明显低于⑶DP单用组。　　结论：在普通肿瘤细胞系、SP细胞、裸鼠移植瘤三个层面，PEITC均能通过下调Mcl-1蛋白从而增强CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。　　第三部分髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究　　目的：阐明胆囊癌细胞中PEITC对Mcl-1谷胱甘肽化修饰的影响和谷胱甘肽化修饰对Mcl-1稳定性的调控。　　方法：使用PEITC处理胆囊癌GBC-SD细胞，观察其对细胞内Mcl-1 mRNA、还原型谷胱甘肽（GSH)/氧化性谷胱甘肽（GSSG)比例、GSH水平、Mcl-1蛋白表达量、Mcl-1谷胱甘肽化修饰等的影响。并确定Mcl-1蛋白的谷胱甘肽化修饰位点，突变修饰位点致Mcl-1无谷胱甘肽化修饰后，观察突变是否影响PEITC下调Mcl-1蛋白。　　结果：　　1.PEITC通过蛋白酶体途径降解胆囊癌细胞Mcl-1蛋白。　　2.PEITC通过降低细胞内GSH水平和GSH/GSSG比例从而降解Mcl-1蛋白。　　3.PEITC增加胆囊癌细胞内Mcl-1的谷胱甘肽化修饰。　　4.半胱氨酸16、286是Mcl-1谷胱甘肽化修饰位点。　　5.突变谷胱甘肽化修饰位点能减慢PEITC降解Mcl-1蛋白。　　结论：　　1.PEITC能降低胆囊癌细胞内GSH水平和GSH/GSSG比例，进而增加Mcl-1的谷胱甘肽化修饰，减弱蛋白稳定性，促进其被蛋白酶体降解，从而增加⑶DP对胆囊癌细胞的杀伤作用。　　2.此作用受半胱氨酸16、286两个Mcl-1谷胱甘肽化修饰位点的调控。　　第四部分信号传导与转录激活因子3的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究　　目的：阐明胆囊癌细胞中STAT3的谷胱甘肽化修饰对Mcl-1蛋白生成的调控及对化疗敏感性的影响。　　方法：使用丁硫氨酸-亚砜亚胺（L-Buthionine-sulfoximine，BS0)处理胆囊癌GBC-SD细胞，观察其对细胞内GSH/GSSG比例、GSH水平、Mcl_l、STAT3蛋白表达量、STAT3谷胱甘肽化修饰等的影响。分对照、BS0、CDDP、BS0/⑶DP联合处理4组，处理胆囊癌GBC-SD细胞，M T T检测细胞活力，流式细胞术定量细胞凋亡率，试剂盒检测细胞caspase3活性。　　结果：　　1.BS0抑制胆囊癌细胞STAT3激活并下调Mcl-1蛋白表达。　　2.BS0明显降低细胞内GSH水平和GSH/GSSG比例。3.BS0增加STAT3的谷胱甘肽化修饰。　　4.BS0增加⑶DP对胆囊癌细胞的杀伤作用。　　结论：　　BS0增加STAT3的谷胱甘肽化修饰，抑制其激活从而抑制下游Mcl-1蛋白生成，增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。　　总之，本实验揭示了抗凋亡蛋白Mcl-1是胆囊癌细胞对⑶DP耐药、胆囊癌SP细胞更耐药的新原因；发现了谷胱甘肽化修饰调控Mcl-1蛋白稳定性的新机制：Mcl-1谷胱甘肽化修饰的增加会减弱蛋白稳定性，促其被蛋白酶体降解；首次证实了半胱氨酸16、286是Mcl-1的谷胱甘肽化修饰位点；PEITC通过调控Mcl-1谷胱甘肽化修饰促其降解，增加⑶D P杀伤作用经过了肿瘤细胞系、SP细胞和裸鼠移植瘤模型的验证，安全有效，有较好的临床应用价值。此外，通过增加STAT3谷胱甘肽化修饰从而抑制下游Mcl-1蛋白生成，也能增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。