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[背景]众所周知,丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)信号转导通路是细胞内一类非常重要的信号转导通路,MAPK家族有三条经典的亚族通路分别是细胞外调节蛋白激酶1和2(extracellular signal-related kinases 1 and 2, ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-Activated Protein Kinase, p38MAPK).这些MAPK通路被脂多糖(LPS)等多种因素激活后,通过复杂的细胞内信号的传导,可产生大量的炎性介质,从而促进炎症的发生发展。ERK、JNK、p38MAPK通路活化的标志是其磷酸化形式表达量的增多。白藜芦醇(Resveratrol)广泛存在于藜芦、虎杖、葡萄、花生等多种食物和食物中。最初作为一种植物抗毒素被发现,目前因具有可靠而广泛的抗炎作用日益受到人们的重视。白藜芦醇可用于腐蚀性食管炎、急性胰腺炎和结肠炎等多种炎症性疾病的治疗,但其具体的抗炎机制尚未清楚。既然MAPK通路可以促进炎症的发展,因此我们设想白藜芦醇的抗炎机制是否与MAPK通路的抑制有关系。白藜芦醇的抗炎机制与MAPK炎性通路关系的文章鲜有报道,本研究是在小鼠巨噬细胞系RAW264.7研究白藜芦醇对MAPK炎症信号转导通路的作用。[目的]在RAW264.7研究白藜芦醇对MAPK炎症信号转导通路的作用。[方法](1)检测不同浓度的白藜芦醇对细胞活性的影响。实验分组：①调零组：DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基组②空白对照组：未处理的细胞组③处理组：加入白藜芦醇和脂多糖的细胞组,每个组设五个复孔。将密度为1×105／ml的细胞100μl接种于96孔板,在37℃,含有5%二氧化碳增湿的培养箱中孵育24小时使细胞良好贴壁,然后加入白藜芦醇和脂多糖,使其白藜芦醇培养基的终浓度分别为5μmol/l、10μmol/l、15μmol/l、30μmol/l,脂多糖的终浓度为1μg/ml,继续孵育24小时后,加入10ul的cck-8(Cell Counting Kit-8)溶液,混匀,孵育2个小时,后用酶标仪在450nm处扫描吸光度。(2)探索脂多糖激活MAPK的时间梯度。将细胞接种于培养皿中,在37℃,含有5%二氧化碳增湿的培养箱孵育,待细胞生长至培养皿的百分之八十至九十时且生长良好时,将细胞从培养箱中取出,超净台中加入脂多糖,混匀后放入培养箱继续培养,本实验用六个不同的培养皿分别用来检测不同的时间点脂多糖对MAPK的激活情况。待设定的时间点到之后,将细胞从培养箱中取出,倒掉培养基,用冷的PBS(phosphate-buffered saline).冲洗培养皿,后将PBS甩干净,加入细胞裂解液,用细胞刮刮除培养皿的皿底,将所得移入ep管中,置于冰上,裂解30分钟,期间每五分钟震荡一次,一次一分钟,充分震荡,后放入4℃离心机,14000g离心5分钟,取出后取上清,按照蛋白：上样缓冲液等于4：1的比例加入上样缓冲液,沸水中煮沸,使蛋白变性,零下20℃保存。BCA蛋白定量,sds-page凝胶等量上样跑电泳,然后切胶,封闭,孵育一抗和二抗,然后发光显影。(3)检测不同浓度的白藜芦醇对MAPK通路的影响。实验分组：对照组、脂多糖组,脂多糖加不同浓度的白藜芦醇组。将白藜芦醇加入培养基中,使其在培养基中的终浓度分别为5μmol/l、10μmol/l、15μmol/l、30μmol/l,孵育2个小时以后加入脂多糖共同孵育半个小时,PBS清洗培养皿,裂解细胞,提取蛋白,BCA蛋白定量后,进行western blot操作基本同前。[结果]：(1)不同浓度的白藜芦醇对细胞活性的影响我们用CCK-8检测了不同浓度的白藜芦醇对细胞活性的影响,发现5—15μM浓度范围的白藜芦醇对细胞活性没有影响,当白藜芦醇浓度达到30μM时,细胞活性开始下降。(2)脂多糖对MAPK通路的活化为了探索MAPK通路被脂多糖激活后,磷酸化蛋白的表达何时达到高峰,本实验在脂多糖刺激后的六个不同的时间点用western blot对MAPK通路蛋白的表达进行了检测,MAPK三个亚族磷酸化蛋白的表达都是在5分钟时开始升高,30分钟时达到高峰,60分钟时已经下降。(3)白藜芦醇对MAPK通路的影响我们发现5-15μM浓度范围的白藜芦醇对细胞活性没有影响,而当白藜芦醇浓度达到30μM时,细胞活性开始下降。因此在这一步的实验中选择的药物浓度为5-15μM。5-15μM浓度范围的白藜芦醇抑制了MAPK家族中p38 MAPK,JNK的磷酸化,5μM的白藜芦醇就可以抑制p38 MAPK的磷酸化,而对JNK磷酸化的抑制则需要白藜芦醇的浓度达到15μM,5-15μM浓度范围的白藜芦醇对ERK的磷酸化没有影响。[结论]：5-15μM浓度范围的白藜芦醇可以抑制p38 MAPK和JNK的磷酸化,对ERK1／2的磷酸化没有影响。