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伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,可引起母猪流产、死胎;成年猪则呈隐性感染,长期带毒排毒,严重影响种猪场生产及优良品种的推广,给养猪业造成极大的损失。目前,我国绝大部分猪场对于该病的防治,主要采用疫苗(弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗)免疫,可以在一定程度上减轻该病的危害,但随之存在猪群带毒、产品的药物残留、毒力返强等问题。本试验从病毒与宿主之间的关系出发,研究宿主自身的差异与病毒之间的关系,将为控制和预防猪伪狂病找到新的方法。
本试验从猪的脑组织中成功克隆出了PRV受体nectin-1基因和nectin-2基因,采用直接测序法对61头猪的nectin-1基因和nectin-2基因进行了SNP位点的扫描,检测到猪nectin-1基因存在6个新的SNP位点,即第162 bp处C/A碱基突变,第288 bp处T/C碱基突变,第393 bp处A/G碱基突变,第662 bp处G/A碱基突变,第1137 bp处T/C碱基突变,第1183 bp处G/A碱基突变。猪nectin-2基因存在2个新的SNP位点,分别是第963 bp处G/A碱基突变,第1029 bp处C/T碱基突变,但都对应位点的氨基酸残基不发生改变。对nectin-1所编码的氨基酸序列分析发现第162位,288位,393位,1137位四处的突变位点并不引起所编码氨基酸序列的改变,为同义SNP,第662位,第1183位处核苷酸序列的改变可引起编码的氨基酸序列发生改变,分别引起氨基酸序列第221位由谷氨酰胺变为异亮氨酸,第395位由精氨酸变为缬氨酸。
试验对克隆出的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪nectin-1基因的编码区含有1 548个核苷酸,编码515个氨基酸,其中信号肽由30个氨基酸组成,胞外域由325个氨基酸组成,含有8个潜在的N-糖基化位点和7个半胱氨酸残基,跨膜区由23个氨基酸组成,胞浆区由37个氨基酸组成,猪nectin-1基因与犬、马、家鼠、人、恒河猴、牛、和兔的nectin-1基因核苷酸序列同源性分别为92.2%、93.4%、89.3%、92.2%、89.6%、93.8%和89.6%;推导氨基酸序列的同源性分别为96.1%、96.3%、93.4%、96.5%、92.4%、95.9%和92.7%。猪nectin-2基因的编码区含有1440个核苷酸,编码479个氨基酸,其中信号肽由32个氨基酸组成,胞外域由330个氨基酸组成,含有2个潜在的N-糖基化位点和六个半胱氨酸残基,跨膜区由23个氨基酸组成,胞浆区由94个氨基酸组成,猪nectin-2基因与犬、马、家鼠、人、恒河猴、牛、和黑猩猩的nectin-2基因核苷酸序列同源性分别为85.4%、85.7%、78.6%、82.1%、82.1%、81.9%和82.1%;推导氨基酸序列的同源性分别为84.5%、83.0%、74.7%、75.7%、76.4%、78.4%和75.5%。
为了进一步验证nectin-1基因两个有义SNP位点的存在,能否引起个体抗伪狂犬病毒的抵抗力发生改变,我们采集了有SNP位点和没有SNP位点猪原代肺泡巨噬细胞做了病毒感染力测定,结果为:nectin-1无改变、氨基酸序列第221位和第395位改变的PAM细胞PRV的半数细胞培养物感染量(TCID50)分别为:10-4.64/0.1 mL,10-4.48/0.1 mL,10-4.9/0.1 mL。